View source for Učinkovit pristop za sintezo funkcionalnega IgG z uporabo rekonstruiranega brezceličnega sistema za sintezo proteinov

Imunoglobulini G (IgG) so molekule, ki se uporabljajo v raziskavah ter kot terapevtska sredstva. Zaradi zapletenega sestavljanja IgG se za njihovo izražanje uporabljajo predvsem sesalske celične linije. Glavna težava takih ekspresijskih sistemov je priprava celic za izražanje rekombinantnih monoklonskih IgG, saj lahko postopki priprave celic trajajo zelo dolgo. V primerih, ko izvajamo visoko zmogljivo izražanje in presejanje, npr. v začetnih stopnjah razvoja terapevtskih IgG, je tak pristop neučinkovit. Zato se razvijajo postopki, kjer za proizvodnjo IgG uporabljajo brezcelične sisteme za sintezo proteinov [1]. 

== Brezcelični sistemi za sintezo proteinov ==

V grobem ločimo dve vrsti tovrstnih sistemov: brezcelične sisteme, ki temeljijo na celičnih lizatih (''E. coli'' ali drugih celic) ter rekonstruirane brezcelične sisteme. Prvi so časovno in cenovno bolj učinkoviti od sesalskih ekspresijskih sistemov, vendar celični lizati poleg potrebnih komponent vsebujejo še organele, nukleaze, proteaze in druge razgradne encime. To onemogoča optimizirano izražanje, poleg tega je nujno, da protein pred nadaljnjo obdelavo dobro očistimo. Rekonstruirani brezcelični sistemi so sestavljeni zgolj iz očiščenih komponent, za katere vemo, da so potrebne pri prepisovanju in prevajanju. Prednost takih sistemov je predvsem zmanjšanje kontaminant ter možnost prilagajanja reakcijskih pogojev (koncentracije in razmerja med komponentami) za dosego čim večjega izražanja. Primer takega sistema je sistem PURE ('protein synthesis using recombinant elements'), ki vsebuje vse glavne komponente translacijskega aparata bakterije ''E. coli''. Komponente so iniciacijski, elongacijski, sprostitveni in terminacijski dejavniki, aminoacil-tRNA sintetaze, metionil-tRNA transformilaze, RNA-polimeraza T7, ribosomi, molekule tRNA, nukleozid trifosfati (NTP), kreatin fosfat, aminokisline in še nekaj drugih molekul [2]. 

== Sinteza in zvijanje IgG ==

Nativna oblika IgG je sestavljena iz dveh težkih in dveh lahkih verig, verige so med seboj povezane z disulfidnimi vezmi. V imunskih celicah B so težke verige IgG monoglikozilirane, vendar so ugotovili, da do pravilnega zvijanja in želene biološke funkcije pride tudi v odsotnosti glikozilacije. Značilnost imunoglobulinov je visoka vsebnost prolinskih aminokislinskih ostankov. Za pravilno zvitje domen je potrebna izomerizacija prolinskih ostankov iz ''trans'' v ''cis'' konformacijo. To je glavna stopnja, ki omejuje hitrost zvijanja domen [3]. Izomerizacijo katalizirajo encimi peptidil prolil izomeraze, v ''E. coli'' je eden od njih FkpA. Ključna za pravilno zvitje je tudi pravilna tvorba disulfidnih vezi znotraj samih Ig domen in med verigami. V ER B-celic za to skrbijo protein disulfid izomeraze, pri ''E. coli'' pa take encime najdemo v periplazemskem prostoru (DsbC). ER B-celic vsebuje tudi protein BiP, šaperon družine Hsp70, ki se veže na intermediate zvijanja IgG [4]. V ''E. coli'' je njegov ortolog DnaK. 

== Sinteza trastuzumaba s sistemom PURE ==

Cilj raziskave je bil optimizacija pogojev sinteze IgG, pri čemer so si kot modelni IgG izbrali trastuzumab, ki se uporablja kot terapevtsko protitelo proti HER2 (receptor človeškega epidermalnega faktorja 2), ki se povečano izraža pri nekaterih oblikah raka. 

Kot matrico za izražanje so uporabili produkta PCR z zapisom za težko oziroma lahko verigo izbranega IgG, ki so jima dodali promotor T7, Shine-Dalgarnovo zaporedje, konstruktu s težko verigo so na 3'-konec pripeli še oznako FLAG. Matrici so v razmerju 1:1 dodali v osnovno mešanico sistema PURE in inkubirali 16 ur na 37 °C. Po končani inkubaciji so na gel nanesli topno in netopno obliko mešanice in ugotovili, da se obe verigi izražata v netopni obliki, zato so poskus nadaljevali z optimizacijo. 

Topnost so povečevali z dodatkom šaperona DnaK in kofaktorjev ter protein disulfid izomerazo DsbC. Po dodatku DnaK sta se obe verigi izražali v topni obliki, vendar ni prišlo do formacije celotnega kompleksa IgG. Ta se je pojavil šele ob dodatku optimalne količine DsbC in glutation disulfida (GSSG), ki je deloval kot oksidant. Sledila je optimizacija redoks stanja sistema. Ugotovili so namreč, da je količina nastalega IgG znatno odvisna od vrste reducenta. Tako so namesto DTT-ja, ki je že predhodno prisoten v sistemu PURE, uporabili glutation in optimizirali razmerje med glutationom in glutation disulfidom. Sledilo je testiranje različnih šaperonskih proteinov, ki naj bi glede na literaturo povečali količino produkta. Testirali so DnaK, FkpA in Skp in ugotovili, da je najboljši za zvitje IgG šaperon DnaK. V nadaljevanju so optimizirali pogoje reakcije: temperaturo in čas inkubacije. Ugotovili so, da največji izplen pravilno zvitega trastuzumaba dobijo pri inkubaciji 28 ur pri 37 °C. Kasneje so podobne poskuse naredili tudi z nekaterimi drugimi terapevtskimi IgG in ugotovili, da so optimalni pogoji za različne IgG različni. Optimizirali so tudi stehiometrično razmerje matric lahke in težke verige – optimalen je eno- do dvokraten prebitek zapisa za težko verigo. 

== Zaključek ==

Po končani optimizaciji so dosegli izkoristek 124 μg/mL (na začetku je ta znašal 33 μg/mL), pri čemer je bil delež lahkih in težkih verig v trastuzumabu 45 % glede na celotno koncentracijo sintetiziranih težkih in lahkih verig. Sinteza je bila končana v dveh dneh. Koncentracija endotoksinov v sistemu PURE je zelo nizka, zato bi lahko izražen IgG uporabili v poskusih s celicami brez čiščenja (redčitev mora biti več kot 400-kratna). 



Viri

[1] S. Murakami, R. Matsumoto, T. Kanamori: Constructive approach for synthesis of a functional IgG using a reconstituted cell-free protein synthesis system. ''Sci Rep.'' '''2019''', 9, 671. doi: 10.1038/s41598-018-36691-8.

[2] Y. Shimizu, A. Inoue, Y. Tomari, T. Suzuki, T. Yokogawa, K. Nishikawa, T. Ueda: Cell-free translation reconstituted with purified components. ''Nat Biotechnol.'' '''2001''', 19, 751–755.

[3] M. J. Feige, L. M. Hendershot, J. Buchner: How antibodies fold. ''Trends Biochem Sci.'' '''2010''', 35(4), 189-98. doi: 10.1016/j.tibs.2009.11.005. 

[4] D. Groff, S. Armstrong, P. J. Rivers, J. Zhang, J. Yang, E. Green, J. Rozzelle, S. Liang, J. D. Kittle, A.R. Steiner, R. Baliga, C. D. Thanos, T. J. Hallam, A. K. Sato, A. Y. Yam.: Engineering toward a bacterial "endoplasmic reticulum" for the rapid expression of immunoglobulin proteins. ''MAbs.'' '''2014''', 6(3), 671-8. doi: 10.4161/mabs.28172.