View source for Načrtovanje kandidatnega cepiva za diabetes tipa I s pomočjo užitnih rastlin, ki izražajo pomemben avtoantigen

Diabetes tipa 1 (T1D) je kronična avtoimunska bolezen, pri kateri pride do uničenja beta-celic trebušne slinavke in posledičnega pomanjkanja inzulina [1]. Trenutno je edini učinkovit način spopadanja z boleznijo nadomeščanje inzulina s pomočjo injekcij ali inzulinskih črpalk. Bolezen zaradi zapletov vseeno vodi do slabšega zdravstvenega stanja in povečane smrtnosti pri pacientih, zato bi tudi omejena povrnitev funkcije celic beta zelo izboljšala kvaliteto življenja. Ena izmed spodbudnejših strategij za zdravljenje T1D je spodbuditev sistemske imunske tolerance z uživanjem avtoantigenov, kot so inzulin, glutamat dekarboksilaza (GAD65), fosfataza IA-2 in cinkov transporter ZnT8 [2]. 

Ker za tovrstno zdravljenje potrebujemo zadostne količine avtoantigena, ki mora biti proizveden na varen, cenovno ugoden in trajnosten način, so raziskovalci iz Univerze v Veroni razvili sistem za pridobivanje avtoantigena GAD65 v rdeči pesi [2]. 

===Avtoantigensko zdravljenje z GAD65===
GAD65 je 65 kDa velika glutamat dekarboksilaza in omogoča pretvorbo glutamata v živčni prenašalec GABA. Točna funkcija GAD65 v trebušni slinavki še ni pojasnjena, predlagano pa je bilo, da GABA regulira sproščanje hormonov iz trebušne slinavke in deluje kot parakrina signalna molekula med endokrinimi celicami Lagerhansovih otočkov [3]. V serumu pacientov s T1D v večini primerov najdemo tudi avtoprotitelesa proti GAD65. Oralno uživanje inzulina, ki je tudi avtoantigen, v določenih eksperimentalnih in kliničnih študijah signifikantno upočasni razvoj T1D, zato znanstveniki domnevajo, da bi lahko uživanje GAD65 koristilo bolnikom, ki imajo v serumu avtoprotitelesa proti temu proteinu. Tovrstno zdravljenje je najbolj učinkovito pri pacientih v zgodnji fazi bolezni [2], [4]. 

===Izražanje avtoantigena v užitnih rastlinah===
Priprava avtoantigenov v užitnih rastlinah je zelo priročna, saj ne omogoča razmnoževanja sesalskih patogenov, ne zahteva drage infrastrukture in omogoča direktno oralno uporabo, brez obsežnega čiščenja učinkovine. Poleg tega se lahko rastline goji lokalno, kar zmanjša potrebo po transportu [2]. 

Raziskovalci so se odločili, da bodo protein prehodno izražali v listnatih poljščinah s pomočjo sistema magnICON®. Pri tem sistemu s pomočjo agroinfiltracije v organizem vnesemo zapis za naš želeni protein in hibridni tobamovirusni genom, ki omogoča replikacijo in širjenje zapisa na sosednje celice [5]. Ta sistem omogoča proizvodnjo večjih količin tarčnega proteina v kratkem času in je primeren za industrijsko uporabo. 

Izbirali so med dvema gostiteljema: špinačo in rdečo peso. Da bi ugotovili v kateri rastlini se protein izraža v večjih količinah so v obeh kandidatih izražali zeleni fluorescenčni protein (ang. green fluorescent protein – GFP) in primerjali količine GFP na dan maksimalnega izražanja. Količina GFP v rdeči pesi je znašala 544.9 ± 10.9 μg/g sveže teže lista (ang. fresh leaf weight - FLW), v špinači pa le 113.4 ± 0.3 μg/g FLW, zato so za nadaljnje eksperimente izbrali rdečo peso. Odločili so se da bodo rekombinantno A. tumificiens v rastlino vstavili s pomočjo vakumskega infiltriranja in optimizirali koncentracijo bakterijskega titra in detergenta.

===Izbira najbolj primerne oblike GAD65===
Z mutiranjem in krajšanjem GAD65 lahko pridemo do produkta z večjim donosom, vendar mora mutirana oblika obdržati imunogene lastnosti divjega tipa proteina. V članku so raziskovalci testirali katalitično neaktivnega mutanta GAD65mut, za katerega so vedeli da ustreza zgornjim kriterijem, razvili pa so tudi na N-koncu skrajšano obliko Δ87GAD65mut. Slednja je bolj topna in stabilna, z 20-krat večjim izplenom [2]. 
Skrajšano obliko so morali imunološko okarakterizirati. V ta namen so primerjali sposobnost prepoznavanja mutirane in nemutirane oblike proteina z avtoprotitelesi izoliranih iz seruma pacientov. Rezultate so statistično obdelali in ugotovili, da je oblika Δ87GAD65mut primerljivo imunogena kot divji tip tega proteina [2].

===Razvoj končnega produkta===
Za razvoj kandidatnega cepiva so znanstveniki v rdeči pesi izražali Δ87GAD65mut ter koncentracijo produkta spremljali s pomočjo prenosa western, kjer so ekstrakte listov rdeče pese analizirali s specifičnimi protitelesi proti GAD65. Količino proteina v lisah so določili s primerjavo s standardno krivuljo rekombinantno izraženega in očiščenega GAD65. Protein se je izražal v količini 201,4 ± 29,3 μg/g FLW, maksimum izražanja je bil 11 dni po agroinfiltraciji.
  
Izbrati so morali še način obdelave rastlinske mase, da učinkovina ostane neokrnjena. Testirali so stabilnost Δ87GAD65mut v hitro zamrznjenih in liofiliziranih listih ter v posušenih listih. Bolj učinkovito je bilo hitro zamrzovanje in liofilizacija svežih listov, saj je bil donos večji. 

Pri oralnih cepivih je treba poskrbeti tudi, da se učinkovina stabilna dostavi v s črevesjem povezano limfoidno tkivo, kjer pride do sprožitve tolerance. Rastlinske celice naj bi bile zadostna zaščita pred nizkim pH in prebavnimi encimi, zaradi prisotnosti težko razgradljive celične stene, vendar pa so raziskovalci po testiranju obstojnosti pri nizkem pH in simulaciji prebave (vzorcu so dodali pepsin), ugotovili, da se učinkovina v takih pogojih razgradi. Predvidevajo, da pri sušenju pride do poškodb celične stene, zato bi bilo treba produkt pred uporabo enkapsulirati [2].

===Zaključek===
Raziskovalci so razvili učinkovit sistem za izražanje proteina Δ87GAD65mut v rdeči pesi. Donos proteina znaša 201,4 ± 29,3 μg/g sveže teže listov. Sistem, ki so ga razvili omogoča pridobivanje rekombinantnega zdravila v roku 2 tednov. Ocenili so, da bi za 70.000 otrok, ki so na svetu letno diagnosticirani s T1D potrebovali 42.000 rastlin rdeče pese, ker zavzema 200 m2 površine rastlinjaka. To bi bilo dovolj za dnevno doziranje 1 mg učinkovine za 8 let [2].

===Viri===
[1]	A. Pugliese, “Autoreactive T cells in type 1 diabetes,” J. Clin. Invest., vol. 127, no. 8, pp. 2881–2891, Aug. 2017.

[2]	E. Bertini et al., “Design of a Type-1 Diabetes Vaccine Candidate Using Edible Plants Expressing a Major Autoantigen,” Front. Plant Sci., vol. 9, p. 572, May 2018.

[3]	J. Ludvigsson, “GAD65: a prospective vaccine for treating Type 1 diabetes?,” Expert Opin. Biol. Ther., vol. 17, no. 8, pp. 1033–1043, Aug. 2017.

[4]	X. Wang et al., “Mechanism of oral tolerance induction to therapeutic proteins,” Adv. Drug Deliv. Rev., vol. 65, no. 6, pp. 759–773, Jun. 2013.

[5]	H. Peyret and G. P. Lomonossoff, “When plant virology met Agrobacterium: the rise of the deconstructed clones.,” Plant Biotechnol. J., vol. 13, no. 8, pp. 1121–35, Oct. 2015.