View source for Sistem za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki

Izvorni članek: M. E. Lee, W. C. DeLoache, B. Cervantes, and J. E. Dueber, “A Highly Characterized Yeast Toolkit for Modular, Multipart Assembly,” ACS Synth. Biol., vol. 4, no. 9, pp. 975–986, Sep. 2015.
<ref>M. E. Lee, W. C. DeLoache, B. Cervantes, and J. E. Dueber, “A Highly Characterized Yeast Toolkit for Modular, Multipart Assembly,” ACS Synth. Biol., vol. 4, no. 9, pp. 975–986, Sep. 2015.</ref>

<h2>'''Uvod'''</h2>
Večina klonirnih sistemov v sintezni biologiji je namenjena za delo z bakterijami, saj je njihova uporaba enostavnejša, kljub temu da imajo kvasovke, kot enocelični evkariontski modelni organizem še posebej pomembno vlogo v industriji. Leta 2015 so na univerzi v Kaliforniji predstavili klonirni sistem, ki poenostavi več dni trajajoče postopke kloniranja in izražanja proteinov v kvasovki ''S. cerevisiae'' in omogoči njihovo uporabo v inženirske namene. V kombinaciji z novo tehniko so predlagali tudi metode urejanja genoma, s katerimi je mogoče v največji meri poenotiti stopnjo in način izražanja genov.

<h2>'''MoClo'''</h2>
Metoda sestavljanja je izpeljanka metode MoClo oziroma Modular Cloning in je hierarhična nadgradnja metode Golden Gate, ki jo poznamo od leta 2011 <ref>E. Weber, C. Engler, R. Gruetzner, S. Werner, and S. Marillonnet, “A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs,” PLoS One, vol. 6, no. 2, p. e16765, Feb. 2011.</ref>. To je modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov s pomočjo restriktaz tipa IIs. Posamezni biološki deli so razdeljeni v skupine, vsi deli iste skupine so izmenljivi. Orodje, ki so ga pripravili, vsebuje 8 tipov delov. To so promotorji, terminatorji, fluorescenčni proteini, peptidne oznake, selekcijski markerji, replikatorji, zaporedja za integracijo v genom in zaporedja, ki omogočajo uvajanje dvojnih prelomov DNA.

Zaporedja posameznih osnovnih delov so iz izvorne DNA, to je funkcionalno zaporedje, ki je preko sestavljanja z BsmBI z ustreznimi adapterji povezano v plazmid. Zbirko osnovnih delov predstavlja torej 96 '''plazmidov bioloških delov'''. Vsi deli istega tipa v plazmidu imajo na koncih primerno orientirana prepoznavna zaporedja za restriktazo BsaI. Samo s sestavljanjem delov različnega tipa v ustreznem zaporedju lahko direktno skonstruiramo plazmid. Plazmidi delov se tako preko metode sestavljanja z BsaI sestavijo v kasetne plazmide. Kasetni plazmid predstavlja celotno transkripcijsko enoto (TU) in omogoča izražanje vsebovanega gena v kvasovkah. Vsaka transkripcijska enota v '''kasetnem plazmidu''' se nahaja med povezovalnima deloma, vsak povezovalni del pa vsebuje prepoznavno zaporedje za BsaI in BsmBI. Z metodo sestavljanja z BsmBI se več transkripcijskih enot lahko sestavi v '''večgenske plazmide'''. Taki plazmidi vsebujejo le restrikcijska mesta za BsaI, BsmBI in NotI, slednje služi za restrikcijsko analizo. V nadaljevanju so natančneje opisani nekateri tipi delov, ki so predstavljeni v zbirki vektorjev.

<h3>'''Promotorji'''</h3>
Set, ki so ga pripravili, obsega 19 konstitutivnih promotorjev, 2 promotorja, ki sta specifična za paritveni tip celice in 2 inducibilna promotorja. Vsi promotorji so bili klonirani iz genoma kvasovke S. cerevisiae seva BY4741, obsegajo 700 bp neposredno pred kodonom start.

Konstitutivni promotorji so bili izbrani tako, da zajemajo širok spekter transkripcijskih moči. Predhodno je že bilo pokazano, da transkripcijska moč konstitutivnih promotorjev v genomu kvasovk ni odvisna od kodirajočega zaporedja, ki sledi. To pri bakterijah vedno ne drži.

Za omogočanje dinamične kontrole izražanja genov so v set vključili tudi promotorje, specifične za paritveni tip in inducibilne promotorje. Promotorja, specifična za paritveni tip sta ''pMFA1'' in ''pMFα1'', prvi je iz haploidne celice paritvenega tipa a, drugi pa iz haploidne celice paritvenega tipa α. Pri sporulaciji kvasovke gre za mejotsko delitev, zato se genomi spor posameznega tipa razlikujejo, kar vpliva na stopnjo izražanja genov <ref>I. Herskowitz, “Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae,” Microbiological Reviews, vol. 52, no. 4. American Society for Microbiology (ASM), pp. 536–553, 1988.</ref>.

Inducibilni promotor ''pGAL1'' se regulira z dodatkom galaktoze, natančnejšo regulacijo pa dosežemo, če ga uporabimo v kombinaciji s sevom, ki nima zapisa za ''GAL2'', transporter galaktoze. Drugi inducibilni promotor ''pCUP1'' se regulira z dodatkom bakrovega (II) sulfata.

<h3>'''Terminatorji'''</h3>
Terminatorji so klonirani iz kvasovke ''S. cerevisiae'' seva BY474, obsegajo pa 225 bp navzdol od kodona stop šestih kvasnih genov z največjo stopnjo izražanja. Izbrani so terminatorji genov s približno enako stopnjo izražanja. V primeru aplikacij tehnike za uporabo sistemov, ki so občutljivi že na majhne spremembe ekspresije, pa je vseeno potrebno preverjanje različnih kombinacij promotorjev in terminatorjev.

<h3>'''Oznake za razgradnjo'''</h3>
Oznake za razgradnjo so fuzirane na N-konec proteina. Predstavljajo dodatno stopnjo regulacije na ravni izražanja, uporabljene pa so oznake, ki korelirajo z različno stopnjo razgradnje, Ubi-M s šibko, Ubi-Y s srednjo in Ubi-R z veliko stopnjo razgradnje proteina.

<h2>'''Optimizacija in uporaba nove tehnike'''</h2>
V kombinaciji z opisano metodo MoClo pri kvasovki so predlagane določene oblike vnosa DNA v gostiteljsko celico, izbira replikatorja in metode urejanja genoma, s katerimi je mogoče doseči čim bolj enotno izražanje proteinov v vseh celicah v kulturi. Želena raven izražanja proteina je lahko regulirana z izbiro ustreznega promotorja, terminatorja, stopnjo razgradnje in številom kopij gena, ki so prisotne v celici.

<h3>'''Uravnavanje števila kopij gena v celici'''</h3>
Ko v celico vnašamo več genskih zapisov hkrati, pogosto pride do težav. V primeru uporabe plazmidov se relativno število kopij med njimi razlikuje, zato pride do razlik v količini izraženih proteinov s posameznega plazmida. Efekt je še bolj opazen pri plazmidih z večjim številom kopij in ga težko nadzorujemo. Stalno število kopij genskega zapisa v celici lahko zagotovimo z integracijo v genom, če želimo večje število kopij genskega zapisa, pa uporabimo plazmid z nizkim številom kopij na celico, na katerem so zapisi za vse komponente, ki jih želimo izražati. Predlagan replikator je CEN5/ARS4.

<h3>'''Optimizacija integracije genskega zapisa v genom'''</h3>
Kvasovke so primeren organizem za integracijo v genom, saj imajo visoko stopnjo homologne rekombinacije. Predlagan postopek vnosa genskega zapisa v kvasovko je transformacija celic z linearno matrico DNA, ki ima na koncih podaljške, katerih zaporedje je homologno tarčnemu lokusu na genomu, po predhodni transformaciji s plazmidom z zapisom za endonukleazo. Preizkušeni sta bili dve endonukleazi. V prvem primeru je šlo za predhodno transformacijo kvasovk s plazmidom z zapisom za Cas9 in ustrezno gRNA, v drugem pa s plazmidom z zapisom za I-SceI.

Pripravili so eksperimentalni sev iz haploida Mata seva S288C, ki v genomu vsebuje prepoznavno zaporedje za I-SceI, znotraj njega pa se nahaja tudi zaporedje PAM oziroma protovmesniku bližnji motiv, ki je prepoznavno zaporedje za Cas9. Za to zaporedje so vstavili delni, nefunkcionalni zapis za ''URA3'' s terminatorjem. Matrična DNA je bila v obliki konstrukta fluorescenčnega proteina Venus, ''HIS3'' in drugega dela zapisa za ''URA3''. Na obeh koncih matrice sta bila podaljška, katerih zaporedje je homologno tarčnemu zaporedju na genomu in po vnosu dvojnega preloma v tarčnem lokusu omogočata homologno rekombinacijo. Z uporabo haploidnega seva se možnost za uspešnost homologne rekombinacije na osnovi sintetične matrice poveča, saj po dvojnem prelomu DNA ni naravne matrice, na podlagi katere celični popravljalni mehanizmi poškodbo popravijo <ref>Z. Mao, M. Bozzella, A. Seluanov, and V. Gorbunova, “DNA repair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells,” Cell Cycle, vol. 7, no. 18, pp. 2902–2906, Sep. 2008.</ref>.

Po uspešni transformaciji, rezanju s Cas9 oziroma I-SceI in homologni rekombinaciji so celice prototrofi za uracil in histidin ter fluorescirajo. Če pride do integracije na napačno mesto v genomu, celice niso prototrofi za uracil in rastejo na gojišču s 5-FOA, kar omogoča identifikacijo izventarčnih mest rezanja. Povečano učinkovitost transformacije so opazili, če so plazmid z zapisom za Cas9 in gRNA oziroma I-SceI pred transformacijo linearizirali.

<h3>'''Nadgradnja sistema: integracija v genom brez selekcijskega markerja na matrici'''</h3>
Z adaptacijo metode CRISPR/Cas9 je mogoče hkrati delovati na več tarčnih mest v genomu tudi ob uporabi matrice brez zapisa za selekcijski marker.

Matrica je v tem primeru zasnovana tako, da vsebuje zapis za tarčni gen na kromosomu, namesto zaporedja PAM pa vsebuje zapis za kodon stop. Na vsakem koncu matrice so tudi v tem primeru podaljški, homologni tarčnemu zaporedju protovmesnika na kromosomu. Z izbiro ustreznih genov, kot so geni, katerih produkti sodelujejo pri sintezi aminokislin, lahko s homologno rekombinacijo v njihov genomski zapis vstavimo predhodni kodon stop in tako v genom vnesemo avksotrofije. Izbrani geni so bili ''LEU2'', ''URA3'', ''MET15'' in ''TRP1''.

Postopek poteka enako kot je opisano zgoraj. V prvem koraku se kvasne celice transformira s plazmidom z zapisom za Cas9 in ustreznimi gRNA, sledi transformacija s pripadajočimi linearnimi matricami za homologno rekombinacijo. Po uspešni transformaciji, rezanju s Cas9 na ustreznem zaporedju in uspešni homologni rekombinaciji na mestih dvojnega preloma, se v zapis na kromosomu vstavi kodon stop in celica ni sposobna sintetizirati aminokisline, ki je produkt tarčnega gena. Selekcijo lahko izvedemo z gojišči brez ustrezne aminokisline, ustrezen genotip pa potrdimo s sekvenciranjem zraslih kolonij.

Uspešnost metode je v primeru enega tarčnega gena do 100%, z večanjem števila tarč pa pada. V primeru hkratnega ciljanja štirih je okoli 20%.

<h2>'''Zaključek'''</h2>
Razvita metoda skupaj z zbirko delov različnih tipov predstavlja enostaven način sestavljanja večjih konstruktov in večgenskih plazmidov. Namenjena je predvsem integraciji želenih zapisov v genom, predstavljeni sta dve možnosti uvajanja dvojnih prelomov DNA na želenih mestih, s katerima se učinkovitost integracije v genom dodatno poveča. Metodo so tudi dodatno nadgradili, da jo je mogoče uporabiti za uvajanje večih zapisov v genom v enem samem koraku transformacije.

<h2>'''Viri'''</h2>
<references/>