View source for NoTox – sistem za preprečevanje botulinskih izbruhov

NoTox je iGEM projekt iz leta 2019, katerega avtorji so študentje iz Univerze v Nottinghamu, Anglija. Cilj projekta je bil pomagati proizvajalcem hrane izboljšati procese pakiranja in produkcije, da bi preprečili izbruhe botulizma.

Spletna stran projekta NoTox, iGEM 2019: https://2019.igem.org/Team:Nottingham

Avtorica povzetka: Patricija Miklavc

=='''Botulizem'''==
Toksin botulin je nevrotoksin, ki ga proizvaja Gram pozitivna, obligativno anaerobna, sporogena bakterija ''Clostridium botulinum'' (''C. botulinum''). Gre za enega najbolj potentnih toksinov, ki ga poznamo. Spore ''C. botulinum'' so odporne na toploto in so pogosto razširjene v naravi<ref> E. A. Johnson, M. Bradshaw: Clostridium Botulinum and Its Neurotoxins: A Metabolic and Cellular Perspective. Toxicon 2001, 39, 1703–1722.</ref>. V permisivnih pogojih pričnejo tvoriti strupe. Takšne pogoje lahko najdemo, kadar so živila kontaminirana (npr. živila s sporami, ki vsebujejo surove sestavine) in so pakirana pod anaerobnimi pogoji (npr. v zaprtih plastičnih vrečkah). Premalo konzervirana, neustrezno predelana, domača konzerva ali doma ustekleničena hrana, je povezana z večjim tveganjem, da vsebuje toksine. Poleg tega, vnaprej pripravljena hrana za uživanje predstavlja veliko grožnjo, saj bi potencialno predhodno nastali toksin zaužili nepoškodovan, saj ga ne bi uničili s segrevanjem<ref> R. K. Dhaked, M. K. Singh, P. Singh, P. Gupta: Botulinum Toxin: Bioweapon & Magic Drug. Indian J. Med. Res. 2010, 132, 489–503.</ref>. Izbruhi botulizma so redki, vendar lahko povzročijo visoko stopnjo obolevnosti in umrljivosti. Med letoma 1920 in 2014 so po vsem svetu poročali o 197 izbruhih, večina (55%) pa se jih je pojavila v ZDA<ref> S. Fleck-Derderian, M. Shankar, A. K. Rao, K. Chatham-Stephens, S. Adjei, J. Sobel, M. I. Meltzer, D. Meaney-Delman, S. K. Pillai: The Epidemiology of Foodborne Botulism Outbreaks: A Systematic Review. Clin. Infect. Dis. 2017, 66, S73–S81.</ref>. Po Nacionalnem programu za nadzorovanje botulizma Ameriških centrov za nadzor in preprečevanje bolezni (CDC) se v ZDA vsako leto zgodi približno 200 posameznih primerov in 10% teh je smrtnih.

=== Preprečevanje botulizma v prehrambni industriji ===
Proizvajalci hrane na splošno upoštevajo stroge smernice za predelavo in konzerviranje hrane, s čimer zavračajo zahtevo po rutinskem testiranju botulinskega toksina. Zadostna toplotna obdelava, ustrezen pH hrane, ustrezna koncentracija natrijevega klorida in nizka aktivnost vode so vsi pogosti pogoji, ki jih lahko uporabimo za zmanjšanje tveganja za rast ''C. botulina'' in s tem toksinogeneze. Ko pa se razvijajo nova živila in postopki pakiranja, je pogosto treba ugotoviti, ali nudijo ustrezno zaščito pred rastjo ''C. botulina''. To je še posebej pomembno, če sestava ali postopek hrane odstopa od vnaprej določenih smernic o varnosti hrane. V teh primerih je treba izvesti ustrezno vzorčenje in testiranje o ustreznosti živil. Takšno testiranje je uveljavljen korak preverjanja varnosti hrane in kakovosti ter zagotavlja najbolj neposreden dokaz o varni uporabi in stabilnosti izdelka v času trajanja. Testiranje vključuje namerno inokulacijo živilskih izdelkov s ''C. botulinum'' (inokulira se mešanica proteolitičnih ali neproteolitičnih ''C. botulinum'' sevov, kar se nato inkubira pri različnih temperaturah), da se ugotovi, ali pride do nastanka toksinov v pričakovanih pogojih skladiščenja. Za test na ''C. botulinum'' je potrebno dokazati, da je tvorjenje toksinov preprečeno => samo štetje celic na gojiščih, ki so sposobne preživeti, ni dovolj, saj se lahko v hrani tvori botulin toksin brez znatnega povečanja števila teh sporogenih bakterij. Prisotnost toksina je mogoče preveriti z biološkim testom na miših (kjer enostavno preverjamo letalnost). Vendar pa se je pojavil interes živilske industrije, da se minimizira oz. v celoti zamenja testiranje na živalih. S časom so zato pričeli z izvajanjem validiranih in vitro poskusov (npr. s pomočjo ELISA)<ref> M. Bradshaw, K. M. Marshall, J. T. Heap, W. H. Tepp, N. P. Minton, E. A. Johnson: Construction of a Nontoxigenic Clostridium Botulinum Strain for Food Challenge Studies. Appl. Environ. Microbiol. 2010, 76, 387–393.</ref>. 


=='''Projekt NoToX'''==
Osnovna ideja je bila uporabiti sintezno biološki pristop, da so naredili varno in dostopno tehnologijo za napovedovanje botulinskega toksina v hrani, brez da bi rokovali s toksičnim ''C. botulinom'' med testiranji. Tehnologija zaznave je sestavljena iz varnega (netoksičnega) C. botulinskega seva, ki namesto toksina izraža lahko zaznaven reporter. Sev pa se obnaša enako kot divji tip ''C. botulinum'' v smislu sporogenosti, rasti in tvorbe toksina/reporterja in zato je primerna alternativa pri testiranju kontaminirane hrane. Zato so uporabili ''C.sporogenes'', ki je netoksičen sorodnik ''C.botulinuma''. Naredili so ''C. sporogenes'', ki proizvaja ustrezen reporter pod kontrolo nativnega botulinskega toksinskega ekspresijskega mehanizma. Ekspresija reporterja je oponašala ekspresijo toksina. Kot reporter so uporabili aceton, ki ga lahko detektirajo z elektronsko sondo, ki ima receptorje, ki so podobne nosnim receptorjem in zaznavajo aceton.

=== Zakaj so uporabili ''C.sporogenes''? ===
Ker obstaja 99 % sekvenčna podobnost med ''C.sporogenes'' in ''C.botulinum'' glede na 16S rRNA sekvenčne eksperimente => 16S rRNA je komponenta 30S majhne podenote prokariontskega ribosoma, ki se veže na Shine-Delgarnovo zaporedje<ref> J. L. Brown, N. Tran-Dinh, B. Chapman: Clostridium Sporogenes PA 3679 and Its Uses in the Derivation of Thermal Processing Schedules for Low-Acid Shelf-Stable Foods and as a Research Model for Proteolytic Clostridium Botulinum. J. Food Prot. 2012, 75, 779–792.</ref> in ker sta oba Gram-pozitivna, anaerobna organizma, ki lahko tvorita endospore

=== Inženiring reporterskih in kontrolnih sevov ''C. sporogenes'' ===
==== Aceton kot reporter ====
Aceton je hlapen, na splošno neškodljiv plin, ki se ga zazna s senzorjem in s tem se znebimo potrebe po vzorčenju hrane in njenem procesiranju. Omogoča realno detekcijo tudi pri kompleksnejših prehrambnih okoljih.
Operon za produkcijo acetona je sestavljal naslednje gene:
•	Tiolazni gen (''thl'')
•	CoA-transferazna podenota A / B (''ctfA'' in ''ctfB'')
•	Acetoacetat dekarboksilaza (''adc'')

==== GusA reporterski sistem ====
β-glukuronidaza (GusA) iz ''E. coli'' je ena od kolorimetričnih reporterjev, ki se pogosto uporabljajo v Clostridijih. Je visoko občutljiv in specifičen reporterski sistem. GusA metabolizira ne-fluorescenčni substrat (4-metilumberiferil glukuronid) v fluorescentni 4-metilumbeliferon. Nivo fluorescence je odvisen od količine GusA encima.

==== FAST reporterski sistem ====
FAST (fluorescence-activating and absorption-shifting tag), se tudi uporablja v ''C. sporogenes''. Gre za majhen (14 kDa), komercialno razvit protein, ki fluorescira le kadar se veže na izbran fluorofen (npr. TFAmber). Zaradi take velikosti, se lahko uporablja tudi za označevanje določenih proteinov, kar nadalje omogoča njihovo mikroskopiranje in detekcijo. Fluorescentni signal se generira takoj po vezavi fluorogena na FAST in zahteva le merjenje končne točke, za oceno ravni izražanja oz. fluoresciranja. Gre za hitrejšo alternativno GusA reporterja.


=== Načrtovanje konstruktov ===
Gen ''botR'' kodira alternativni faktor sigma, ki je odgovoren za transkripcijsko aktiviranje genov botulinskega nevrotoksina v ''C. botulinum''<ref> B. Dupuy, S. Raffestin, S. Matamouros, N. Mani, M. R. Popoff, A. L. Sonenshein: Regulation of Toxin and Bacteriocin Gene Expression in Clostridium by Interchangeable RNA Polymerase Sigma Factors. Mol. Microbiol. 2006, 60, 1044–1057.</ref>. Postavitev reporterja pod nadzor promotorja BotR (npr. PNTNH) je način posnemanja izražanja toksinov v ''C. sporogenes''. Za posnemanje izražanja toksina v ''C. sporogenes'' potrebni dve komponenti:
•	BotR izražanje
•	Izražanje reporterja pod nadzorom BotR promotorja

Prototipski reporterski sev so ustvarili z integracijo toksin-ekspresijske mašinerije, ki se imenuje ''botR'' in vsebuje nativni promotor PbotR, v kromosom ''C.sporogenes''. Nato so gene, za katere je bilo predvideno, da omogočajo proizvodnjo acetona, vključili v vektor navzdol od promotorja in ga povezali z izražanjem botulinskega nevrotoksinskega kompleksa (PNTNH, ki ga prepozna BotR). Operon, ki je povezan s produkcijo acetona pa so razporedili v shuttle plazmid. Transformacija ''botR'' ekspresijskega seva z reporterskim plazmidom pa omogoči produkcijo acetona, ki je marker za nevrotoksinsko produkcijo, brez da bi bila potreba po ravnanju s toksičnim ''C.botulinom''. Zaradi velikosti acetonskega operona, ne bi bilo mogoče umestiti ''botR'' in reporterskih ekspresijskih modulov na isti plazmid. Zato so se odločili za razcepljeno konfiguracijo, s katero bi bil ekspresijski modul ''botR'' integriran v genom ''C. sporogenes'', medtem ko bi bil reporterski ekspresijski modul na drugem plazmidu. Ta konfiguracija je dala tudi večjo fleksibilnost, saj bi lahko iste reporterske plazmide preizkusili v treh različnih ''botR'' ekspresijskih sevih, brez dodatnega kloniranja. To je omogočilo sestavo več kontrol za vsakega od reporterskih in ''botR'' ekspresijskih sevov.

=== ''botR'' ekspresijski modul ===
Uvedba gena botR z njegovim naravnim promotorjem (PbotR) v genom ''C. sporogenes'' je omogočila čimbolj natančno stimulacijo proizvodnje botulinskega toksina v tem organizmu. Zaporedja PbotR in botR so dobili iz genoma ''C. botulinum'' ATCC 3502. PbotR-botR modul so povezali z močnimi dvosmernimi terminatorji navzgor (Tfad) in navzdol (Tfdx). Izbrali so lokus pyrKDE, kot gensko lokacijo za integracijo ''botR''-ekspresijskega modula. Za integracijo tega modula so uporabili RiboCas metodo posredovano s CRISPR/Cas9 genomsko integracijo. Kasete so zasnovalina način, da bi integracija v genom hkrati odstranila ''pyrE'' gen in njegov nativni RBS, ki se nahaja 20 bp upstream. Glede na to, da je PbotR pod vplivom neznanih okoljskih dražljajev, so se tudi odločili, da integrirajo ''botR'' z izvornim RBS navzdol od gena ''pyrD'', ki ga bo izražal nativni promotor pyrKDE operona (PpyrKDE). Pod nadzorom tega promotorja bo ekspresija ''botR'' (in s tem tudi ekspresija reporterja) konstitutivna, kar služi kot pozitivna, od BotR odvisna kontrola. ''botR'' so tudi postavili pod nadzor laktozno-inducibilnega sistema iz C. perfringens (PLAC). To je omogočilo testiranje najmanjšega in največjega dosega ekspresije reporterja. Te informacije bi lahko podale območje detekcije za senzor električnega nosu. Skupaj so bili torej sestavljeni trije različni ''botR''-ekspresijski moduli.

=== Modul za ekspresijo BotR-aktivirajočega reporterja ===
Standardni Clostridium-E. coli shuttle plazmidi pMTL82151 (visoka kopija Gram negativnega replikona) in pMTL82121 (nizka kopija Gram negativnega replikona) so bili izbrani za izražanje reporterskih modulov.
Reporterski geni, sekvence ''C. acetobutylicum'' in ''C. botulinum'' APO, FAST in gusA, so bili nameščeni navzdol od Pntnh promotorja, ki ga aktivira BotR, in jih povezali z izražanjem netoksične nehemaglutininske komponente nevrotoksinskega kompleksa. 

=== Elektronski nos ===
Inženirski cilj so dosegli s proizvodnjo avtomatske, ročne naprave, elektronskega nos, ki določa koncentracije acetona v vzorcu med 50 in 500 PPM (0,86 in 86 mM). Naprava meri koncentracijo aceton v vzorcu hrane glede na koncentracijo v atmosferi. Poleg tega so vključili še dve LED lučki, s katerimi so pokazali, kdaj koncentracija acetona v atmosferi vzorca presega mejo senzorja.

=='''Zaključek'''==
Izdelek bi omogočil varno napovedovanje proizvodnje botulinskega toksina pri pripravi hrane in pakiranju, brez da bi bilo treba plačevati draga testiranja. To bi omogočilo manjšim prehrambnim podjetjem zagotovilo, da je njihov postopek priprave hrano mikrobiološko kakovosten. Prav tako bi se na ta način zmanjšalo število testnih mišk, ki jih uporabljajo v namen testiranja. 

=='''Viri'''==

[1]	E. A. Johnson, M. Bradshaw: Clostridium Botulinum and Its Neurotoxins: A Metabolic and Cellular Perspective. Toxicon 2001, 39, 1703–1722.
[2]	R. K. Dhaked, M. K. Singh, P. Singh, P. Gupta: Botulinum Toxin: Bioweapon & Magic Drug. Indian J. Med. Res. 2010, 132, 489–503.
[3]	S. Fleck-Derderian, M. Shankar, A. K. Rao, K. Chatham-Stephens, S. Adjei, J. Sobel, M. I. Meltzer, D. Meaney-Delman, S. K. Pillai: The Epidemiology of Foodborne Botulism Outbreaks: A Systematic Review. Clin. Infect. Dis. 2017, 66, S73–S81.
[4]	M. Bradshaw, K. M. Marshall, J. T. Heap, W. H. Tepp, N. P. Minton, E. A. Johnson: Construction of a Nontoxigenic Clostridium Botulinum Strain for Food Challenge Studies. Appl. Environ. Microbiol. 2010, 76, 387–393.
[5]	J. L. Brown, N. Tran-Dinh, B. Chapman: Clostridium Sporogenes PA 3679 and Its Uses in the Derivation of Thermal Processing Schedules for Low-Acid Shelf-Stable Foods and as a Research Model for Proteolytic Clostridium Botulinum. J. Food Prot. 2012, 75, 779–792.
[6]	B. Dupuy, S. Raffestin, S. Matamouros, N. Mani, M. R. Popoff, A. L. Sonenshein: Regulation of Toxin and Bacteriocin Gene Expression in Clostridium by Interchangeable RNA Polymerase Sigma Factors. Mol. Microbiol. 2006, 60, 1044–1057.