View source for Robusten in občutljiv sintetični senzor za spremljanje transkripcijskega izhoda signalne mreže citokininov in planta

''Povzeto po članku:'' [https://plantphysiol.org/content/161/3/1066 E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.]

Citokinini so razred fitohormonov, ki spodbujajo delitev celic v rastlinskih koreninah in poganjkih. Vključeni so predvsem v rasti in diferenciaciji celic, vplivajo pa tudi na apikalno prevlado, rast aksialinih brstov in staranje listov [1]. Citokinini sprožijo signalno kaskado večstopenjske fosforilacije (MSP). To pot sproži vezava citokinina na CHASE domeno hibridne histidin senzor kinaze. Posledično pride do avtofosforilacije receptorja na His ostanku in nadaljnji prenos fosfatne skupine na Asp ostanek v domeni oddajnika. Fosfat se nato prenese na fosfotransferni protein, ki se translocira v jedro in lahko nato fosforilira regulatorje odziva (ARR) tipa B. ARR so družina transkripcijskih faktorjev, ki sovpadajo v tip A, B ali C. Pripadniki razreda tipa B se vežejo na promotorje ciljnih genov preko njihove Myb-podobne DNA-vezavne domene in aktivirajo transkripcijo, medtem ko ARR-ji tipa A in tipa C zavirajo signalno aktivnost. Hkrati so ARR tipa A glavna tarča aktiviranih ARR tipa B, kar vzpostavi negativno povratno zanko na signalno pot. Opisano pot lahko tudi aktivirajo citokinin neodvisne kinaze 1 (CKI1) [2], [3].

==Analiza vpliva citokininov==
Največja težava, ki nastane pri raziskovanju vloge MSP, je da citokinini imajo kompleksno biosintezo, transport in razgradnjo, kar oteži določevanje distribucije aktivnih citokininov v rastlinah. Poleg tega, MSP lahko aktivirajo druge od citokininov neodvisne kinaze kot so CKI1. Zaradi tega je najboljši pristop vizualizacije transkripcijskega izražanja MSP s sintetičnim reporterjem, ki razkrije mesta delovanja med razvojem divjega tipa. ARR tipa B se vežejo na 9bp veliko sekvenco, ki ima ohranjeno 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' zaporedje. To ohranjeno zaporedje je omogočilo razvoj dvokomponentnega signalnega senzorja (TCS) z ponavljajočimi 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' vezavnimi mesti. Transgenske rastline, ki vsebujejo TCS promotor z zapisom za GFP (TCS::GFP), so omogočile ugotovitev novih, kot tudi boljše razumevanje že znanih vlog citokininov, ampak so se srečale z nekaterimi težavami. Izražanje s pomočjo TCS je šibko v nekaterih delih rastline kje imamo že imamo zabeleženo vlogo citokininov in izražanje GFP se postopoma zniža z zvišanjem generacije, verjetno zaradi vtišanja ponavljajočih se sekvenc TCS. Zaradi tega so v tem članku razvili izboljšano različico TCSn::GFP, ki se izogiba tem težavam in omogoča močnejši signal. TCS so predvsem optimizirali s spremembo števila vezavnih mest, spremembo faze in spremembo baz med motivi [2].

==Razvoj TCSn==
===Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS===
Analizirali so različna zaporedja TCS vezana z minimalnim 35S promotorjem in zaporedjem za luciferazo, ki so jih prehodno vstavili v primarne mezofilske protoplaste Arabidopsis thaliane z agronifiltracijo. Osnovna biokocka je vsebovala 4 motiva 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' ločenimi z poljubno izbranimi sosednjimi nukleotidi. Biokocke so narejene tako da vsebujejo motive smernih in inverznih ponovitev v vseh možnih orientaciah. Torej, tandemska ponovitev, glava na glavo in rep na rep. Pri 4 ponovitvah niso opazili bistvene razlike v primerjavi z kontorlo, med tem ko se minimalno izražanje pojavilo komaj po 8ih ponovitah. TCS s 16 ponovitev je omogočila podoben signal kot pri luciferazi vezani na ARR6 promotor, ki je sestavljen na osnovi 5' regulativne regije enega izmed ARR tipa A genov. Največje izražanje reporterja so opazili pri 24 ponovitvah motiva, kar nakazuje na močen kooperativni efekt med transkripcijskimi faktorji. Nadaljnje zvišanje števila motivov je imelo inhibitorni vpliv. Tako je zaporedje z 24 motivov bilo izbrano in dobilo ime TCS [2], [4]. Kooperacija ARR-jev tipa B je tudi bila dokazana ''in planta'' [5].

===Določanje faze===
Naslednje so raziskali kako sprememba baz motiva in sosednjih baz vpliva na izražanje reporterja. Razvili so različice TCS, TCS*, ki vsebuje mutacije v motivu in TCSfm, ki vsebuje mutacije v sosednjih bazah. Ugotovili so da so promotorji postali neobčutljivi na citokinine in da je verjetno ''in vitro'' določen motiv 5'-(A/G)GAT(C/T)-3' nezadosten za prepoznavo z ARR tipa B ''in vivo''. Zaradi tega je potrebno še optimizirati sosednje baze, kako bi izboljšali TCS [2].

===Določanje razdalja med motivi===
Testirali so še različice TCS, ki ima 9bp parov razdalje, z različnimi razdaljami med motivi in preverili njen vpliv na izražanje. Različica z 7bp razdalje je pokazala znižanje v aktivnosti, dokler je različica z 11 bp pokazala močnejšo aktivnost. To se sklada z dejstvom da DNA rabi 11 bp da naredi obrat v heliksu v njeni B konformaciji in da faziranje vezavnih mest s tem številom bp na splošno omogoča največjo aktivnost transkripcijskih faktorjev [2]. 

===Optimizacija s pomočjo bioinformatske analize===
Kako bi ugotovili katera vezavna mesta se nahajajo v divjih tipih Arabidopsis thaliane in s tem ugotovili kako da zvišajo izražanje in se izognejo vtišanju TCS, analizirali so vezavna mesta za ARR tipa B. Analizirali so 3kbp sekvenco navzgor od prepisanega zaporedja kot tudi prepisano zaporedje ARR tipa A genov, ker se tam ponavadi nahaja cis-regulativno zaporedje in iskali zaporedje 5'-(A/G)GAT(C/T)-3'. Čeprav je to zaporedje bolj pogosto v analiziranih sekvencah, še vedno bi se najdlo vsakič na 108bp v naključni DNA. Zaradi tega so zvišali specifičnost tako da so iskali motive, ki so odaljeni vsaj 6 bp, ker je dolžina samega motiva 5bp in ne več kot 30bp, ker so iskali motive v gručah. Ugotovili so da se motivi nahajajo na 7 do 14bp en od drugega v povprečju in da se smerne in inverzne ponovitve pojavijo enako pogosto. Dodanih je bilo po 3 bp na vsak konec iskanih motivov (poglej podpoglavlje Določanje faze). Sekvence, ki jih spremlja podaljšek 5', 5'-A-3' in/ali 3' podaljšek, 5'-T-3' se pojavljajo pogosteje. Ugotovili so tudi da se sekvenca 5'-AA(A/G)GAT(C/T)TT-3' izredno bolj pogosto nahaja v tarčnih genov citokininov v primerjavi z kontrolnimi geni. Na osnovi teh informacij ustvarili so 12 motivov (Tabela 1). Ti sintetični motivi so bili naključno združeni, da so dobili sintetično zaporedje, ki vsebuje 24 vezavnih mest v vseh mogočih orientacijah (poglej podpoglavje Optimalno število vezavnih mest in razvoj TCS). S tem razvojem so omogočili da je izražanje reporterskega gena bolj enakomerno in da ne pride do vtišanja zaradi monotonosti [2].

{| class="wikitable" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align:center; border: 1px solid darkgray; border-collapse: collapse; background: none;"
|+'''Tabela 1: Motivi uporabljeni v TCSn'''
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|
! style="width: 70px; background: #CEF2F2;border: 1px solid darkgray"|zaporedje
|- 
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |1
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT

|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |2
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GAGAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |3
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATCTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |4
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |5
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAAGATTTAT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |6
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTT
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |7
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |CAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |8
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |9
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |TAAAGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |10
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |AAAGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |11
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |GTTGGATTTTG
|-
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |12
| style="background: #FCFCFC;border: 1px solid darkgray" |ATGGGATCTTG
|}

==Specifičnost in občutljivost TCSn==
Kako bi preverili občutljivost in specifičnost TCSn, transficirali so protoplaste z TCSn konjugirano z luciferazo. Ugotovili so da se pojavi večji signal v primerjavi z TCS in da ne pride do nespecifičnega izražanja v prisotnosti nekaterih drugih fitohormonov. Kotransfekcija z ojačevalci MSP, kot so CKI1 in ARR tipa B je zvišala izražanje reporterja, medtem ko je kotransfekcija z ARR tipa A, torej inhibitorji MSP, znižala izražanje. Pri nekaterih ojačevalcih je prišlo do ojačanja signala v primerjavi z TSC, dokler je pri drugih ostalo isto. Specifičnost je tudi preverjena z transkripcijskimi faktorji, ki imajo podobno vezavno zaporedje kot ARR tipa B in ugotovljeno je da ne aktivirajo izražanje niti TCS niti TCSn. Do aktivacije pride tudi v monokaličnicah zaradi podobnosti ARR tipa B genov pri vseh rastlinah. Analizirali so še izražanje reporterja v rastlinah, ki so bile transficirane z konstruktom TCSn::GFP in ugotovili da pride do močnejšega signala v primerjavi z tistimi rastlinami, ki so transficirane z TCS::GFP ARR5::GFP. V sadikah teh rastlin so inducirali CKI1 in ARR10:SRDX, ARR tipa B protein konjugiran z represorjem fosforilacije, ki vtiša MSP. V tistih z induciranim CKI1 je zabeležena vseprisotna aktivnost reporterja, dokler je v tistih z ekspresijo ARR10:SRDX zabeleženo utišanje GFP-ja. S temi analizami so potrdili da TSC specifično izraža aktivnost MSP. Poleg tega, po treh generacijah transgenih rastlin ni bilo opaziti zmanjšanja ravni GFP, kar kaže, da za razliko od TCS::GFP, TCSn::GFP ni podvržen vtišanju transgena [2].

==Vzorci izražanja TCSn::GFP==
Trasfekcija rastlin z TCSn::GFP je pokazala izražanje reporterja, ki se sklada z že znanimi vlogami citokininov. Poleg tega, za razliko od TCS::GFP, ekspresija TCSn::GFP je aktivna še v poznih stadijih ženske embriogeneze. V primerjavi z TCS::GFP, signal je bistveno slabši v suspenzorskih celicah in celic, ki nastanejo iz njih, dokler je signal močnejši pri provaskularnih in bodočih celicah meristema poganjka. Do tega pride, verjetno ker niti en promotor ni optimiziran da ga aktivirajo vsi ARR tipa B enako. TCS lahko odraža boljše pogoje vezave za skupino ARR tipa B, izraženih v suspenzorskih celicah, medtem ko se v vseh drugih tkivih zdi, da TCSn zagotavlja boljše pogoje. V drugih regijah je na splošno izražanje kvalitativno enako, ampak bolj močno kot v primerjavi z TCS::GFP [2].

==Zaključek==
Razvoj od TCS odvisne ekspresije reporterskih genov je omogočil izboljšanje do takrat znanih modelov in odkritje ne znanih funkcij citokininov. Ampak, pri njihovoj uporabi pride do težav. Zaradi tega je razvit TCSn, ki za razliko od TCS, ima večjo občutljivost na citokinine, bolj izbalansiran odgovor na različne ARR-je tipa B in ni podvržen vtišanju zaradi monotonosti sekvence. To bo tudi olajšalo ukrštanje TCSn::GFP linije z različnimi drugimi linijami in omogočilo raziskanje manj znanih vlog MSP [2]. 

==Viri==
[1]	J. J. Kieber, ‘Tribute to Folke Skoog: Recent Advances in our Understanding of Cytokinin Biology’, J. Plant Growth Regul., vol. 21, no. 1, pp. 1–2, Mar. 2002, doi: 10.1007/s003440010059.

[2]	E. Zürcher, D. Tavor-Deslex, D. Lituiev, K. Enkerli, P. T. Tarr, and B. Müller, ‘A Robust and Sensitive Synthetic Sensor to Monitor the Transcriptional Output of the Cytokinin Signaling Network in Planta’, Plant Physiol., vol. 161, no. 3, pp. 1066–1075, Mar. 2013, doi: 10.1104/pp.112.211763.

[3]	C. E. Hutchison and J. J. Kieber, ‘Cytokinin Signaling in Arabidopsis’, Plant Cell, vol. 14, no. suppl 1, pp. S47–S59, May 2002, doi: 10.1105/tpc.010444.

[4]	B. Müller and J. Sheen, ‘Cytokinin and auxin interplay in root stem-cell specification during early embryogenesis’, Nature, vol. 453, no. 7198, pp. 1094–1097, Jun. 2008, doi: 10.1038/nature06943.

[5]	M. Veerabagu et al., ‘The Arabidopsis B-type response regulator 18 homomerizes and positively regulates cytokinin responses’, Plant J. Cell Mol. Biol., vol. 72, no. 5, pp. 721–731, Dec. 2012, doi: 10.1111/j.1365-313X.2012.05101.x.