View source for HyDRA – detekcija vodika

HyDRA je iGEM projekt iz leta 2019, katerega avtorji so študentje iz Univeze Macquarie v Avstraliji. Cilj projekta je bil rešiti problem detekcije vodikovega plina z izdelavo biosenzorja.

Spletna stran projekta HyDRA, iGEM 2019, https://2019.igem.org/Team:Macquarie_Australia 

Avtor povzetka: Andrej Ivanovski

==='''Detekcija vodika'''===
Zaznavanje vodikovega plina je zahtevno ker je brez barve in vonja ter je eksploziven že pri 4% v/v koncentraciji v zraku. Današnji detektorji vodikovega plina so nagnjeni k navkrižni in napačni občutljivosti ponavadi zaradi prisotnost drugih plinov (CO, NH3, H2S)<ref> Ozawa A, Kudoh Y, Murata A, Honda T, Saita I, Takagi H. Hydrogen in low-carbon energy systems in Japan by 2050: The uncertainties of technology development and implementation. International Journal of Hydrogen Energy. 2018 Sep 27;43(39):18083-18094.</ref>. Bistveno izboljšanje specifičnosti detektorjev vodika je nujno potrebno v panogah, kot so transport zemeljskega plina, proizvodnja biohidrogena, presejalnih testov bakterijskih kultur za identifikacijo najboljših bakterijskih sevov, ki proizvajajo vodik<ref> Schrader P, Burrows E, Ely R. High-Throughput Screening Assay for Biological Hydrogen Production. Analytical Chemistry. 2008;80(11):4014-4019.</ref> ter različne raziskave v morju, kjer obstaja večja verjetnost napačnih odčitkov iz obstoječih senzorjev<ref> Raj VB, Nimal AT, Parmar Y, Sharma MU, Sreenivas K, Gupta V. Cross-sensitivity and selectivity studies on ZnO surface acoustic wave ammonia sensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 2010 Jun 3;147(2):517-24.</ref>.

=='''Projekt HyDRA'''==
Kot nujna potreba po izboljšanju tehnologij zaznavanja vodikovega plina so študenti uporabili pristope sintezne biologije, tako da so naredili bakterijsko kulturo ''Escherichia coli'', ki deluje kot biosenzor vodikovega plina. Biološki sistemi so v splošnem naravno razviti da se hitro odzivajo na spremembe v medceličnem in zunajceličnem okolju, kar je njihova edinstvena lastnost, ki jo je mogoče uporabiti pri zasnovi sinteznega biosenzorja. Zelo specifična narava znotrjaceličnih encimov kot sestavni del biosenzorja se lahko odzove le na tarčno spojino, kar učinkovito odpravi možnost navzkrižne občutljivosti senzorja.
Biosenzor vodika je sestavljen iz dveh delov:
1. Senzorična Ni-Fe 2c hidrogenaza iz ''Magnetospirillum magneum''. Hidrogenaza je sestavljena iz štirih podenot, majhna podenota, velika podenota, proteazna podenota in digvanilat ciklazna / ciklična-di-GMP fosfodiesterazna podenota. 
2. Ciklični di-GMP Riboswitch iz ''Candidatus Desulforudis audaxviator'', skupaj z reporterskim proteinom, izboljšanim zelenim  fluorescenčnim proteinom (eGFP).
Med transkripcijo eGFP se sekundarni sporočevalec ciklični di-Gvanozin monofosfat (di-GMP) veže na ciklični di-GMP Riboswitch in ustvari terminatorsko zanko, ki preprečuje translacijo reporterskega proteina. Terminatorska zanka nastane le, kadar je ciklični di-GMP vezan na svoj aptamer. V prisotnosti vodika hidrogenaza aktivira svojo ciklično-di-GMP fosfodiesterazno aktivnost, ki razgradi ciklični di-GMP, kar omogoča translacijo eGFP. Kombinacija senzoričnega in reporterskega sistema omogoča takojšnjo zaznavanje vodikovega plina.

=== Senzorična komponenta biosenzorja ===
Ni-Fe 2c hidrogenaza iz ''Magnetospirillum magneum'' je sestavljena iz štirih podenot (majhna podenota, velika podenota, dozorevalna proteazna podenota in diguanilat ciklaza / ciklični-di-GMP fosfodiesteraza). Četrta podenota se lahko obnaša kot digvanilat ciklaza (katalizira tvorbo cikličnega di-GMP) ali kot ciklična di-GMP fosfodiesteraza (razgradi ciklični di-GMP). Aktivnost te domene se modulira z vezavo molekularnega vodika na hidrogenazno podenoto encima<ref> Greening C, Biswas A, Carere C, Jackson C, Taylor M, Stott M et al. Genomic and metagenomic surveys of hydrogenase distribution indicate H2 is a widely utilised energy source for microbial growth and survival. The ISME Journal. 2015;10(3):761-777.</ref>, <ref> Søndergaard D, Pedersen C, Greening C. HydDB: A web tool for hydrogenase classification and analysis. Scientific Reports. 2016;6(1).</ref>, <ref> Frey M. Hydrogenases: Hydrogen-Activating Enzymes. ChemBioChem. 2002;3(2-3):153-160.</ref>.
Za določanje funkcionalnosti hidrogenaznega dela encima iz M. Magnetum so določili stopnje nasičenja in porabe vodika v vodi, v bakterijskih celic ''E.coli'' DH5α z dodanim zapisom za hidrogenazo (DH5ɑ + hidrogenaza) in bakterijskih celic ''E.coli'' DH5ɑ brez zapisom za hidrogenaze. Stopnja nasičenosti v vodi je bila najvišja, sledila sta ji bakterijska kultura s hidrogenazo (DH5a +hidrogenaza) in bakterijska kultura brez hidrogenaze (DH5ɑ - hidrgenaza). Podobno je bila tudi stopnja porabe, v vodi najvišja, sledila sta ji ‘DH5ɑ + hidrogenaza’ in ‘DH5ɑ - hidrogenaza’. Pri dodatku glukoze k bakterijskih kultur ni prišlo do proizvodnje vodika kar je dodatno potrdilo da hidrogenaza deluje samo v smeri oksidacije vodika.
Aktivnost fosfodiesterazne podenote encima so določili s spremljanjem nastanka biofilmov.  Koncentracija cikličnega di-GMP je premo sorazmeno povezana s tvorbo biofilma v bakterijskih kulturah, zato so z merjenjem adherentne lastnosti celic poskušali spremljati koncentracijo cikličnega di-GMP, ki pa je obratno sorazmena z aktivnostjo ciklične di-GMP fosfodiesteraze. 

=== Sekundarni sporočevalec (The middle man) ===
Ciklični-di-GMP je sekundarni sporočevalec prisoten v večini bakterijskih celic. Predvsem uravnava transkripcije genov kot odziv na stres (RpoS σS) in vpliva na bakterijske faze rasti. Vpleten je tudi v  biosintezo celuloze in resičaste fimbrije, ki predstavljajo glavne komponente biofilma<ref> Hengge R. Principles of c-di-GMP signalling in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 2009;7(4):263-273.</ref>.

=== Odzivna komponenta biosenzorja ===
Biosenzor vodika kot odzivno komponento uporablja ciklični di-GMP Riboswitch iz ''Candidatus Desulforudis audaxviator''. Riboswitch iz tega organizma je bila izbrana, ker ima znano strukturo in znano nukleotidno zaporedje. Riboswitch predstavlja terciarna struktura mRNA, ki lahko uravnava translacijo genov preko vezave efektorske molekule. Pri vezavi na terminatorsko zanko efektorska molekula prepreči tvorbo rRNA kompleksa in translacijo mRNA zaporedja<ref> Hengge R. Principles of c-di-GMP signalling in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 2009;7(4):263-273.</ref>,<ref> 8.	 Sudarsan N, Lee E, Weinberg Z, Moy R, Kim J, Link K et al. Riboswitches in Eubacteria Sense the Second Messenger Cyclic Di-GMP. Science. 2008;321(5887):411-413.</ref>. . V vodikovem biosenzorju efoktorska molekula ki se veže na Riboswitch strukturo je ciklični di-GMP.
Navzdol od Riboswitch strukture se nahaja vezavno mesto za ribosom in reporterski protein eGFP. Na ta način je translacija eGFP obratno sorazmena z znotrajcelično koncentracijo cikličnega di-GMP. Ciklični di-GMP se veže na aptamer Riboswitch strukture in tvori terminatorsko zanko. Nastala terminatorska zanka potem prepreči translacijo reporterskega proteina eGFP.
Da bi preizkusili delovanje Riboswitch strukture, so razvili dva konstrukta, ki vsebujeta Riboswitch zaporedje in eGFP; prvi konstrukt vsebuje območje terminatorske zanke znotraj Riboswitch zaporedja in drugi  je brez terminatorske zanke. Hipoteza je bila, da konstrukt, ki ne vsebuje terminatorske zanke, bo konstitutivno izražal eGFP, ne glede na celično koncentracijo cikličnega-di-GMP. Zaradi te konstantne aktivnosti so konstrukt poimenovali "R-ON". Drugi konstrukt, ki je vseboval terminatorsko zanko bi imel vtišano izražanje eGFP zaradi vezanega cikličnega di-GMP, ta konstrukt so poimenovali "R-OFF".
Ker koncentracija cikličnega di-GMP variira glede na fazo bakterijske rasti in je najvišja v začetku stacionarne faze bakterijske rasti so izbrali stacionarno fazni promotor osmY, ki bo aktiven le pri stacionarni fazi bakterijske rasti. Delovanje konstrukta so preverili tudi z dvema drugima inducibilnima promotorja, Lac promotor in Tac promotor, da bi na ta način okarakterizirali različne promotorje.
Da bi  potrdili delovanje biokocke, ki jo sestavljata promotor osmY in ciklični di-GMP Riboswitch so naredili fluorescenčni test. Rezultati testa kažejo da pri promotorji Lac in Tac sevi imajo bistveno višjo izražanje eGFP pri konstruktih R-OFF. Povečana raven eGFP pri R-OFF konstruktih je najverjetneje posledica različne moči promotorjev. Najverjetneje je to posledica dejstva, da vezava cikličnega di-GMP na transkript povzroči krajše transkripte, kar omogoči, da RNA polimeraza hitro ustvari več transkriptov in na ta način porabi znotrajceličnega cikličnega di-GMP, kar pa povzroči izgubo inhibicije reporterskega eGFP. Pri stacionarno faznim promotorjem osmY pa do tega pojava ni prišlo in v celotnem eksperimentu je koncentracija eGFP ostala konstantna kar potrdi hipotezo da je stacionarno fazni promotor osmY najbolj primeren za biosenzor vodika. 
Da bi dokazali povezavo med fosfodiesteraze in Riboswitch strukture, so konstruirali dva plazmida, ki vsebujeta zapis za riboswitch in  eGFP (bodisi R-ON kot R-OFF) pod stacionarno faznim promotorjem osmY ter zapis za fosfodiesterazo yhjH pod induciabilnim Lac promotorjem. Po sestavljanju konstruktov so izvedli  transformacijo bakterijskih sevov E. coli DH5α in E. coli Nissle 1917.
Transformirane celice E. coli DH5α so uporabili za izvedbo fluorescenčnega testa. Rezultati testa potrjujejo hipotezo, da konstrukt R-OFF povzroča znatno nižje ravni eGFP zaradi inhibicije s strani cikličnega di-GMP.
Transformirane celice E. coli Nissle 1917 so spremljale na LB ploščah, z dodanim barvilom Congo rdeče in Coomassie modro. Primerjali so učinek izražanja fosfodiesteraze yhjH v R-ON transformantov  ter učinek izražanja pri R-OFF transformantov. Rezultati kažejo da indukcija fosfodiesteraze yhjH nima vpliva na fluorescenco pri celicah, ki vsebujejo R-ON konstrukta, kar potrjuje  hipotezo, da znotrajcelična koncentracija cikličnega di-GMP ne vpliva na izražanje eGFP. Pri celicah z R-OFF konstruktom  inducirano izražanje fosfodiesteraze yhjH znatno poveča fluorescenco, kar tudi potrdi hipotezo, da zmanjšanje koncentracije cikličnega di-GMP-ja s strani fosfodiesteraze omogoča znatno povečanje izražanja eGFP.

=== Integracija vodikovega biosenzorja ===
Po uspešnem sestavljanju biosenzorja na koncu so oblikovali različne prototipe biosenzorjev za različne namene.
En izmed prototipv je biosenzor za gasilce. Pri pogovorih z gasilcih v Avstraliji so sklepali da pri njihovem delu največji problem je hitra detekcija različnih hlapov, ki so lahko vnetlji in predstavljajo veliko nevarnost pri njihovem delu. 
Zato so naredili prototip, ki bo v 30 sekundah zaznal povišano koncentracijo vodika. Glede na trenutno prisotnih senzorjev, biosenzor ima povišano življensko dobo ker trenutni sezorji trajajo le 16 ur in zahtevajo mesečno menjavo baterij. Biosenzor bi imel tudi poenostavljeno legendo da so odčitki jasni in da ne prihaja do zmede. Do pozitivnega signala bi prišlo pri 40 000 ppm vodika v zraku in signal bo zelene barve (označen kot nevarnost na napravi). Nad bakterijsko kulturo E.coli bo tudi postavljeno prozorno plastično steklo, ki bo preprečevalo prehajanje bakterijske kulture.

== '''Viri''' ==
<references/>