View source for Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00486 Z. Li, Z. Wu, X. Cen, Y. Liu, Y. Zhang, D. Liu, Z. Chen: Efficient Production of 1,3-Propanediol from Diverse Carbohydrates via a Non-natural Pathway Using 3-Hydroxypropionic Acid as an Intermediate. ACS Synth. Biol. 2021, 10(3), str. 478–486.]

== UVOD ==

1,3-propandiol (1,3-PDO) je široko uporabljeno topilo in pomembna platformna kemikalija, ki služi kot substrat za izdelavo mnogih produktov z dodano vrednostjo. Daleč najbolj izrabljen pa je za pripravo polimerov, in sicer služi kot monomer v sintezi raznih poliestrov, polietrov in poliuretanov. Glavni produkt 1,3-PDO je poli(trietilen tereftalat) (PTT), ki je kopolimer 1,3-PDO in tereftalne kisline. Polimer je široko uporabljen v tekstilni in avtomobilski industriji in za izdelavo vlaken za preproge [1]. 

== PROBLEMATIKA PROIZVODNJE 1,3-PDO ==

Konvencionalno se 1,3-PDO pridobiva s kemijsko sintezo, ki pa ima številne slabosti, kot so potreba po visokih tlakih in temperaturah, uporaba dragih katalizatorjev, sproščanje toksičnih intermediatov, odvisnost od neobnovljivih virov, nizki izkoristki, itd. Zaradi naštetih omejitev je učinkovita biološka sinteza vedno bolj zaželjena [1].

Naravnih proizvajalcev, ki bi 1,3-PDO proizvajali iz sladkorjev ni, obstajajo pa mikroorganizmi (Klebsiella pneumoniae, Clostridium butyricum, Enterobacter agglomerans, Citrobacter freundii, in Lactobacillus brevis), pri katerih je 1,3-PDO naravni produkt anaerobne razgradnje glicerola, pri čemer sodelujeta od koencima B12 odvisna glicerol dehidrataza in 1,3-PDO dehidrogenaza. Problem naravne razgradnje glicerola je, da je glicerol dehidrataza inhibirana s substratom, kar omejuje uporabo visokih koncentracij glicerola kot substrata pri fermentaciji. Poleg tega pri razgradnji nastane mnogo stranskih produktov, čigar nastanek so v preteklosti že poskušali blokirati z metabolnim inženirstvom [2, 3]. Kljub temu pa do sedaj še ni uspelo pripraviti hiperproizvajalca 1,3-PDO, ki ne bi akumuliral nekaterih stranskih produktov, zato so s proizvodnjo 1,3-PDO poskusili v gensko spremenjeni E. coli, kjer so kot substrat uporabili glukozo. S kombiniranjem ustreznih sinteznih poti so dosegli visoke titre 1,3-PDO. A ker E. coli sama po sebi ne proizvaja vitamina B12, je bilo tega potrebno dodajati v gojišče za fermentacijo, kar pa predstavlja velik strošek [3].

Da bi se izognili problemu potrebe po koencimu so poskusili konstruirati od vitamina B12 neodvisne poti, kot sta recimo sinteza 1,3-PDO iz homoserina in malata. Obe poti pa sta se zaradi kompleksne povratne regulacije in slabe učinkovitosti encimov izkazali za precej neučinkoviti [2, 3].

V dotični raziskavi so zato razvili novo od B12 neodvisno sintezno pot, ki temelji na kombinaciji od malonil-CoA odvisne sinteze 3-hidroksipropanojske kisline (3-HP) in pretvorbe 3-HP v 1,3-PDO. Od malonil-CoA odvisna sinteza 3-HP je že dobro poznana, saj je tudi 3-HP pomembna platformna kemikalija. Edini do sedaj znani način redukcije 3-HP v 1,3-PDO pa je kemijski, zato so raziskovalci predlagali dve možni biološki poti in sicer:
* Pot 1: preko 3-hidroksipropionil-CoA (3-HP-CoA), ki jo katalizirajo encimi CoA transferaza ali sintetaza, aldehid dehidrogenaza in alkohol dehidrogenaza.
* Pot 2: neposredna redukcija 3-HPA v 1,3-PDO z uporabo reduktaze karboksilne kisline (CAR) in alkohol dehidrogenaze.

Teoretičen izkoristek obeh poti je enak kot pri zgoraj naštetih poteh, ki uporabljajo glukozo kot substrat. Prednost pa je, da je potreben dodatek le enega (pot 2) oziroma dveh novih encimov (pot 1). V raziskavi so naredili presejanje encimov za umetne poti in ojačali fluks celotne poti z metabolnim inžiniringom [3].

== ISKANJE USTREZNIH ENCIMOV ZA PRETVORBO 3-HP V 1,3-PDO ==

Za pretvorbo 3-HP v 1,3-PDO po poti 1 so potrebni trije encimski koraki. Za zadnji korak so v raziskavi uporabili kar alkohol dehidrogenazo YqhD iz E. coli, ki se je že v predhodnih raziskavah izkazala za učinkovit katalizator redukcije 3-hidroksipropanala (3-HPA) v 1,3-PDO. Za 3-HP specifične CoA transferaze oziroma sintetaze in za 3-HP-CoA specifične aldehid dehidrogenaze pa do sedaj še niso bile dobro proučene, zato so raziskovalci preverili učinkovitost različnih potencialnih kandidatov iz različnih organizmov. Tudi za proizvodnjo 1,3-PDO po poti 2 je bilo potrebno poiskati ustrezno CAR, zato so tudi v tem primeru naredili seznam kandidatnih reduktaz iz različnih organizmov. Učinkovitost encimov so preverili tako, da so pripravili majhno knjižnico celotnih poti, ki so bile sestavljene iz kombinacij različnih kandidatnih encimov. Vsi konstrukti so bili vstavljeni v plazmid pTrc99a, ki pred poliklonskim mestom že vsebuje promotor Ptrc. Vsem zapisom za encime so optimizirali rabo kodona za uporabo v E. coli. V konstrukte za pot 2 so poleg zapisov za kandidatne reduktaze in zapisa za YqhD vključili še zapis za fosfopantetenil transferazo, ki je potrebna za in situ aktivacijo reduktaz karboksilnih kislin. S knjižnico sinteznih poti so nato transformirali E. coli sev BL21 [DE3], uspešno transformirane bakterije pa so nato gojili v minimalnem gojišču M9Y, kateremu so dodali 3-HP z gostoto 2 g/L. Učinkovitost posameznih konstruktov so določili z merjenjem koncentracije nastalega 1,3-PDO s HPLC [3].

Rezultati so pokazali, da je bila v primeru poti 1 pretvorba najbolj učinkovita v primeru uporabe konstruktov, ki so vsebovali zapis za 3-HP-CoA sintetazo PrpE iz organizma Metallosphaera sedula. Od aldehid dehidrogenaz so se za najbolj učinkovite izkazale mutirana aldehid dehidrogenaza iz Clostridium saccharoperbutylacetonicum (bldL273T) in aldehid dehidrogenazi iz K. pneumoniae iz Salmonella typhimurium (pduP_Kp in pduP_St). Sevi z omenjenimi konstrukti so lahko proizvedli 0,9 – 1,0 g/L 1,3-PDO v 60 urah. V primeru poti 2 sta oba seva s konstrukti z zapisom za CAR proizvedla 1,3-PDO, a manj učinkovito kot sevi, ki so vsebovali konstrukte za pot 1. Zato v raziskavi nadaljevali le s sevi, ki so vsebovali sintezno pot 1 (sev BP04 – pTrc-bldL273T-yqhD-prpE, sev BP08 – pTrc-pduP_Kp-yqhD-prpE, sev BP09 - pTrc-pduP_St-yqhD-prpE) [3].

== SESTAVLJANJE CELOTNE POTI PRETVORBE GLUKOZE V 1,3-PDO ==

Do celotne pretvorbe glukoze v 1,3-PDO je torej manjkal še del poti, pri katerem pride do pretvorbe glukoze v 3-HP. Glukoza se v E. coli z glikolizo pretvori v acetil-CoA, ki se nato pretvori v malonil-CoA, ki je potreben za sintezo maščobnih kislin. Za redukcijo malonil-CoA v 3-HP je potrebno v E. coli vstaviti še zapis za ustrezno reduktazo, in sicer je to malonil-CoA reduktaza MCR iz organizma Chloroflexus aurantiacus. MCR je bifunkcionalen encim, ki so ga znanstvaniki že v predhodnih raziskavah razdelili na dva fragmenta, in sicer MCR-C in MCR-N. MCR-C reducira malonil-CoA v malonat semialdehid, tega pa MCR-N reducira v 3-HP. Ločitev fragmentov je smiselna, saj je redukcija z MCR-C omejujoč korak omenjene dvostopenjske reakcije. Z mutagenezo MCR-C je bilo neravnotežje med obema stopnjama minimizirano [4]. Zapisa mcrC* (mutiran mcrC) in mcrN so vstavili v plazmid pCDFDuet-1, ki že vsebuje promotor PT7 z operatorsko regijo iz laktoznega operona. Konstrukt so vstavili v seve BP04, BP08 in BP09 in tako dobili nove seve z oznako BH02, BH03 in BH04. Vsi trije sevi so v gojišču M9Y proizvedli 0,46 – 0,49 g/L 1,3-PDO iz glukoze s koncentracijo 20 g/L. V fermentacijski brozgi sevov BH03 in BH04 pa so zasledili tudi visoke koncentracije etanola, kar so pripisali dokaj nizki specifičnosti aldehid dehidrogenaze PduP – njen naravni substrat je sicer propanal, a je sposobna reducirati tudi acetil-CoA v etanal. Za bolj specifično od PduP se je izkazala dehidrogenaza iz S. typhimurium, zato so z optimizacijo proizvodnje nadaljevali le na sevih BH02 in BH04 [3].

== OPTIMIZACIJA PROIZVODNJE 1,3-PDO IZ GLUKOZE ==

Proizvodnjo 1,3-PDO iz glukoze so poskusili optimizirati s povečanjem sinteze 3-HP. S tem naj bi hkrati tudi povečali razmerje med 3-HP-CoA in acetil-CoA in posledično znižali akumulacijo etanola. Povečano sintezo 3-HP so poskušali doseči z dodajanjem cerulenina, ki je inhibitor sintaze maščobnih kislin. Z inhibicijo tega encima naj bi se zmanjšal fluks skozi sintezo mašobnih kislin in posledično naj bi prišlo do zvišanja koncentracije malonil-CoA, ki ga MCR reducira v 3-HP. Rezultati so pokazali, da je ob dodatku cerulenina prišlo do delne inhibicije celične rasti, hkrati pa je prišlo tudi do povečane proizvodnje 1,3-PDO, in sicer je sev BH02 proizvedel 0,91 g/L produtka v prisotnost 10 μM cerulenina, BH04 pa kar 2,93 g/L (0,35 mol/mol glukoze) v prisotnosti 50 μM cerulenina. Prav tako pa je cerulenin znižal akumulacijo etanola [3].

== PROIZVAJANJE 1,3-PDO Z UPORABO RAZLIČNIH SUBSTRATOV ==

Pri pridobivanju platformnih kemikalij s fermentacijo je vedno večja težnja po uporabi nizkocenovnih in lahko dostopnih substratov za fermenacijo, kot so recimo glicerol, ksiloza in acetat. Uporaba teh substratov bi še izboljšala učinkovitost valorizacije odpadnih materialov in s tem  močno doprinesla h krožnemu gospodarstvu, hkrati pa bi pripomogla h ekonomičnosti fermentacije.3

Pot, ki so jo predlagali v dotični raziskavi, izhaja iz acetil-CoA, ki je osrednji metabolit vseh ogljikovih hidratov. Zato so kot substrate za proizvodnjo preskusili še zgoraj tri naštete ogljikove hidrate, in sicer na sevu BH04, ki se je izkazal za bolj učinkovitega. V prisotnosti 20 g/L glicerola je sev BH04 proizvedel 2,36 g/L 1,3-PDO (0,14 mol/mol glicerola). Do manj učinkovite proizvodnje 1,3-PDO je prišlo tudi pri uporabi ksiloze in acetata, pri čemer je prišlo tudi do akumulacije 3-HP v gojišču. Titer 1,3-PDO bi lahko torej izboljšali z nadaljnim usklajevanjem modulov za sintezo 3-HP in 1,3-PDO [3].

V raziskavi so poskusili povečati obseg proizvodnje z uporabo šaržne fermentacije z dohranjevanjem, pri čemer so kot substrat uporabili glukozo. V 36 urah so tako proizvedli 7,98 g/L 1,3-PDO brez da bi proces podrobneje optimizirali, kar je več kot pri drugih od B12 neodvisnih poteh [3].

== ZAKLJUČEK ==

V raziskavi so raziskovalci predlagali in ovrednotili novo od B12 neodvisno sintezo 1,3-PDO, ki poteka preko intermediata 3-HP. Sprva so poiskali encime za pretvorbo 3-HP v 1,3-PDO, nato pa so proizvodnjo optimizirali z uporabo cerulenina, inhibitorja sintaze maščobnih kislin. Dokazali so tudi, da je pri predlagani novi poti možna uporaba različnih ogljikovih hidratov kot substratov, kar je pomembno zaradi rednih nihanj cen substratov na tržišču. Za izboljšanje učinkovitosti poti in uravnoteženje uporabljenih sinteznih modulov so potrebne nadaljne raziskave na področju metabolnega in proteinskega inženiringa.

== VIRI ==

[1]	G. Kaur, A. K. Srivastava, S. Chand: Advances in Biotechnological Production of 1,3-Propanediol. Biochemical Engineering Journal. Elsevier May 15, 2012, pp. 106–118./n
[2]	C. J. R. Frazão, D. Trichez, H. Serrano-Bataille, A. Dagkesamanskaia, C. M. Topham, T. Walther, J. M. François: Construction of a synthetic pathway for the production of 1,3-propanediol from glucose. Sci. Rep. 2019, 9(1), str. 1–12./n
[3]	Z. Li, Z. Wu, X. Cen, Y. Liu, Y. Zhang, D. Liu, Z. Chen: Efficient Production of 1,3-Propanediol from Diverse Carbohydrates via a Non-natural Pathway Using 3-Hydroxypropionic Acid as an Intermediate. ACS Synth. Biol. 2021, 10(3), str. 478–486./n
[4]	S. Takayama, A. Ozaki, R. Konishi, C. Otomo, M. Kishida, Y. Hirata, T. Matsumoto, T. Tanaka, A. Kondo: Enhancing 3-hydroxypropionic acid production in combination with sugar supply engineering by cell surface-display and metabolic engineering of Schizosaccharomyces pombe 06 Biological Sciences 0601 Biochemistry and Cell Biology. Microb. Cell Fact. 2018, 17(1), str. 176./n