View source for Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso

==UVOD==

Celično pridobljeno meso predstavlja skupek in-vitro kultiviranih in diferenciranih mišičnih zarodnih celic, ki poustvarijo strukturo mišice živali [1]. Poleg rastlinskih nadomestkov predstavlja eno izmed možnih alternativ mesu, s katerimi se raziskovalci trudijo zmanjšati količino vnosa mesa, ki zaradi naraščajoče populacije ljudi predstavlja med drugim tudi preveliko okoljsko breme [2]. Ker je ideja celično pridobljenega mesa poustvariti dejansko konvencionalno meso, se tudi pri tem pojavi problem oksidacije lipidov in proteinov, ki povečajo tveganje za razvoj nekaterih bolezni, poleg tega pa zmanjšajo obstojnost shranjevanja izdelkov. Z vključitvijo metabolnih poti, ki vodijo v biosintezo antioksidantov, bi tako vplivali na izboljšane prehranske lastnosti kot tudi na samo obstojnost produkta. V članku so s “Sleeping-Beauty” (v nadaljevanju SB) transpozonskim sistemom omogočili proizvodnjo karotenoidov v sesalskih celicah z namenom izboljšanja prehranske vrednosti celično pridobljenega mesa [3].

==POTEK EKSPERIMENTA==

V opisanem eksperimentu so raziskovalci uporabili 2 tipa celic, mišje nesmrtne mioblaste (v nadaljevanju C2C12) in primarne satelitne celice, izolirane iz goveda (v nadaljevanju BSC). Načrtali so konstrukt z zapisi za tri ključne encime, ki sodelujejo pri nastanku beta karotena iz prekurzorja geranilgeranil pirofosfata (GGPP), ki je v sesalskih celicah že naravno prisoten. Zapise za encime z vmesnimi samoizrezajočimi peptidi 2A so najprej vnesli v plazmide pCMV-GFP, nato pa konstrukt vnesli v transpozonski vektor s konstitutivnim promotorjem pSBbi-pur. Končni konstrukti so poleg zapisov za encime (CrtB/I/Y) vsebovali še zapis za zeleni fluorescenčni protein (GFP) in zapis za odpornost proti puromicinu. Takšne konstrukte so nato skupaj s plazmidom z zapisom za transpozazo preko lipofekcije vnesli v celice C2C12 in BSC. Transformirane celice BSC in C2C12 so okarakterizirali z imunofluorescenco za Pax7 in za težko verigo miozina. Preko merjenja fluorescence za GFP so določili uspešnost integracije vektorjev, in preverili, kako velikost vključka vpliva na rast celic. Količino nastalih karotenoidov v celicah so določili z metodo HPLC in jih normalizirali na maso proteinov, ki so jo  določili z metodo z bikinhonsko kislino. Ker se vsebnost karotenoidov ni bistveno razlikovala od vsebnosti karotenoidov v konvencionalnem mesu, so se odločili za optimizacijo vsebnosti karotenoidov v BSC in C2C12 s povečanjem koncentracije dodanega puromicina in ketokonazola v gojišču in nato ponovno določili količino karotenoidov na maso proteinov. Kot zadnje so z merjenjem količine celičnega malonaldehida določili še antioksidativno učinkovitost nastalih karotenoidov [3,4,5].

==REZULTATI==

Integracija vektorjev v celice je bila uspešna. Velikost vključka v BSC je negativno vplivala na rast celic, medtem ko je bila pri celicah C2C12 z večjim vključkom povečana rast po 8 dneh v primerjavi s kontrolo. Kvantitativni HPLC je potrdil de novo sintezo karotenoidov. Količina karotenoidov v primeru BSC ni bila bistveno večja od količine v konvencionalnem mesu, medtem ko je bila vsebnost karotenoidov v celicah C2C12 bistveno višja. Z optimizacijo količine karotenoidov so dosegli za 10x večjo količino karotenoidov v BSC. Lipidna oksidacija optimiziranih celic se je v surovih in toplotno obdelanih vzorcih v primeru vključkov Crtb/I in CrtB/I/Y  zmanjšala, kar je tudi bil eden od namenov eksperimenta [3].

==ZAKLJUČEK==
Z eksperimentom, opisanim v članku, so v sesalske celice uspešno vključili metabolne poti iz tujih organizmov in po optimizaciji dobili opazno višjo vsebnost karotenoidov v celicah. Optimizirane celice z vključkoma CrtB/I in CrtB/I/Y so imele v primerjavi s kontrolami zmanjšano lipidno oksidacijo, kar dokazuje, da lahko metabolni inženiring vpliva na izboljšane prehranske vrednosti celično pridobljenega mesa [3]. Pri primerjavi obstoječih možnosti mesnih nadomestkov pa je potrebno še vseeno poleg prehranske vrednosti upoštevati tudi sprejemljivost produtkov s strani potrošnikov, proizvodne cene in vpliv proizvodnje na okolje [2].

==LITERATURA==
[1]	K. H. Choi et al., “Muscle stem cell isolation and in vitro culture for meat production: A methodological review,” Compr. Rev. Food Sci. Food Saf., vol. 20, no. 1, 2021.
[2]	S. Chriki and J.-F. Hocquette, “The Myth of Cultured Meat: A Review,” Front. Nutr., vol. 7, p. 7, 2020.
[3]	A. J. Stout, A. B. Mirliani, E. L. Soule-Albridge, J. M. Cohen, and D. L. Kaplan, “Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods,” Metab. Eng., vol. 62, 2020.
[4]	L. Mátés et al., “Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates,” Nat. Genet., vol. 41, no. 6, 2009.
[5]	E. Kowarz, D. Löscher, and R. Marschalek, “Optimized Sleeping Beauty transposons rapidly generate stable transgenic cell lines,” Biotechnol. J., vol. 10, no. 4, 2015.