View source for Visoko zmogljiv presejalni protokol na osnovi celic za raziskovanje antivirusnih inhibitorjev proti Sars-Cov-2 glavni proteazi (3CLpro)

===Uvod===

COVID-19 je pandemija, ki jo povzroča SARS-CoV-2. Gre za zelo nalezljiv koronavirus, ki po vsem svetu povzroča veliko zdravstveno in gospodarsko breme. Ni posebnih protivirusnih zdravil ali cepiv z dokazano klinično učinkovitostjo za zdravljenje ali preprečevanje okužbe s SARS-CoV-2. Virusne poliproteine predelata dve proteazi: 3C podobna proteaza (3CLpro) in papainu podobna proteaza (PLpro), ki sta dobri tarči za razvoj terapevtskih zdravil. 3CLpro je odgovoren za apoptotični signal, PLpro pa za pomoč koronavirusu pri izogibanju prirojenemu imunskemu odzivu gostitelja. Ciljanje na te encime ima lahko prednosti pri zaviranju replikacije virusov.

===3-Kimotripsinu podobna proteaza (3CLpro)===

Virus 3CLpro cepi virusne poliproteine na 11 mestih. Ta proteaza ima identično zaporedje med koronavirusi in nima človeškega homologa. Asimetrična enota vsebuje samo en polipeptid. Dva izmed polipeptidov (imenovana protomer A in B) se povežeta, da tvorita dimer. Vsak protomer je sestavljen iz treh domen. Domena I (ostanki 8–101) in domena II (ostanki 102–184) imata antiparalelno strukturo β-cevi. Domena III (ostanki 201–303) vsebuje pet α-vijakov, razporejenih v večinoma antiparalelno kroglasto skupino. 3CLpro ima Cys-His katalitično diado in mesto vezave substrata je v razcepu med domeno I in domeno II.

===GFP komplementacija===

GFP vsebuje 11 beta verig (β-verig) in osrednjo α-vijačnico, ki jo lahko razdelimo na tri dele. En del vsebuje devet β-pramenov in osrednjo α-vijačnico (β1–9); drugi del vsebuje 10. β verigo (β10); in tretji del vsebuje 11. β verigo (β11). β1–9 vsebuje tri aminokisline, ki tvorijo kromofor, medtem ko β11 vsebuje visoko konzerviran Glu222, ki katalizira zorenje kromoforja. Ko sta β10 in β11 povezana skupaj ali sta v neposredni bližini, se hitro vežeta na β1–9 in zelena fluorescenca se razvije v nekaj deset minutah. Β10–11 je bil preoblikovan tako, da tvori vzporedno strukturo, potem pa ne bi več ustrezal β1–9. Za preklop β11 so uporabili heterodimerizirne tuljave E5 in K5: povezali β10 / β11 z E5; β11 je sledil K5; zaporedje cepitve proteaze je bilo vstavljeno med β11 in K5. Na podlagi te zasnove heterodimer E5 / K5 "preklopi" β11 in preprečuje samosestavljanje razdeljenega GFP. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori antiparalelno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9 in vodi do povečanja fluorescence.

===Oblikovanje presejalnega testa GFP-Split-3CLpro===

Ta tehnologija je bila uporabljena za razvoj in optimizacijo protokola za visoko zmogljivi presejalni test (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 s presejanjem knjižnice majhnih molekul. Poskus je pokazal, da je ta test preprosta in praktična strategija za pregled velikih knjižnic zdravil na zaviralce proteaz.
Načelo preskusa je odvisno od razdelitve GFP na dve enoti (GFP β1–9 in β10-11), kar ima za posledico izgubo njegove fluorescentne kapacitete. β10–11 ima visoko afiniteto za vezavo na β1–9 in hitro razvije zeleno fluorescenco. Tako je test proteaze split-GFP odvisen od preprečevanja sestavljanja enot GFP in sprožitve sklopa GFP pod aktivnostjo proteaze. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori protit vzporedno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9. Vstavitev mesta cepitve 3CLpro med heterodimer E5 / K5 in β11 omogoča, da 3CLpro sprosti β11 in nadaljuje antiparalelno strukturo z β10.
Izdelana je bila ekspresijska kaseta, sestavljena iz dveh plazmidov. Prvi plazmid vsebuje konstrukt GFP, drugi plazmid pa 3CLpro za so-ekspresijo v celicah HEK293. Celice HEK293T smo sočasno transficirali z rekombinantnim plazmidom pcDNA3.1. Za pomnožitev dveh fragmentov GFP, β-verige 1–9 in β-verige 10-11, smo uporabili standardni PCR. Deset aminokislinskih povezovalnih in cepilnih mest aminokislinskih zaporedij 3CLpro in E5 / K5 smo vstavili v konstrukt GFP z uporabo PCR s prekrivanjem in podaljšanjem. Celice, transficirane samo s konstruktom GFP, ne pa tudi 3CLpro, niso pokazale fluorescenčne aktivnosti pet dni po transfekciji. Fluorescenca GFP se je po 48 in 72 urah dramatično povečala.

===Rezultati===

Vrednotenje protokola GFP-split-3CLpro je bilo izvedeno s pregledom lastne knjižnice 50 spojin majhnih molekul. Na podlagi prejšnjih študij je imela večina spojin že potencialno protivirusno proteazno aktivnost. Boceprevir je bil uporabljen kot pozitivna kontrola. Od vseh preizkušenih spojin so derivati kinazolina povzročili rahlo do znatno zmanjšanje intenzivnosti fluorescence GFP. Med derivati kinazolina je spojina QZ4 znatno zmanjšala fluorescenco GFP. Študija molekularnega priklopa je bila opravljena, da bi ponazorila dajanje QZ4 glavni proteazi SARS-CoV-2. QZ4 se na 3CLpro veže s tremi vodikovimi vezmi z Gln 189, Gln 192 in Arg 188.

===Sklep===

Raziskovalci trdijo, da so razvili nov model celičnih linij za presejanje z visoko prepustnostjo (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 na podlagi komplementacije split-GFP. Ta nova metoda bistveno poveča varnost, prepustnost in obnovljivost protivirusnega presejanja, prav tako pomaga skrajšati čas presejanja zdravil. Z uporabo tega testa so ugotovili nove spojine inhibitorja proteaz, pridobljene iz kinazolina, ki jih je treba nadalje raziskati.

===Viri===

1.	Rothan, H.A., Teoh, T.C. Cell-Based High-Throughput Screening Protocol for Discovering Antiviral Inhibitors Against SARS-COV-2 Main Protease (3CLpro). Mol Biotechnol 63, 240–248 (2021). https://doi.org/10.1007/s12033-021-00299-7

2.	Milech, N., Longville, B., Cunningham, P. et al. GFP-complementation assay to detect functional CPP and protein delivery into living cells. Sci Rep 5, 18329 (2015). https://doi.org/10.1038/srep18329

3.	Zhang Q, Schepis A, Huang H, et al. Designing a Green Fluorogenic Protease Reporter by Flipping a Beta Strand of GFP for Imaging Apoptosis in Animals. J Am Chem Soc. 2019;141(11):4526-4530. doi:10.1021/jacs.8b13042

4.	Jin, Z., Du, X., Xu, Y. et al. Structure of Mpro from SARS-CoV-2 and discovery of its inhibitors. Nature 582, 289–293 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2223-y