View source for Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih

==Uvod== 

Koronavirusna genomska (+)ssRNA deluje kot mRNA, zato lahko takoj po vstopu virusne RNA v citoplazmo gostitelja poteče translacija prvih dveh bralnih okvirjev ORF1a in ORF1b. Tako nastane 16 nestrukturnih proteinov, vključenih v sestavljanje replikacijsko-transkripcijskega kompleksa (RTC). Del predstavlja od RNA odvisna RNA polimeraza (RdRp), ki dalje sintetizira virusno RNA. To sestavljata dva različna procesa. Replikacija virusnega genoma (gRNA) in diskontinuirna transkripcija, katere produkt so krajše subgenomske mRNA (sgmRNA), ki se ujemajo v zaporedjih na 5'- in 3'-koncih in zapisujejo za strukturne ter akcesorne proteine.  

==Osnove replikacije in transkripcije koronavirusov==  

Replikacija virusnega genoma poteka kontinuirno. (+)gRNA se po celotni dolžini prepiše v komplementarno (-)gRNA, ki služi kot matrica za nadaljnjo sintezo kopij virusnih genomov. Posebnost koronavirusov in arterivirusov iz reda Nidoviridae je mehanizem diskontinuirne transkripcije. Med diskontinuirno sintezo (-)sgRNA pride do predčasne terminacije, pri čemer se vodilno zaporedje, ki se nahaja na 5'-koncu genoma združi s 5'-koncem mRNA-kodirajočega zaporedja. Na ta način nastanejo (-)sgRNA z enakim zaporedjem na 5'-koncu, ki predstavljajo matrice za kontinuirno transkripcijo v (+)sgmRNA. Te lahko ribosomi gostitelja prevedejo v funkcionalne virusne proteine. Diskontinuirno transkripcijo uravnavajo interakcije med sekundarni strukturnimi elementi, ki so del neprevajajočih se regij na 5'- in 3'-koncu genoma ter nekaterimi proteini in transkripcijska regulatorna zaporedja (TRS).  

==Transkripcijska regulatorna zaporedja== 

Zaporedje TRS-L se nahaja med 60 in 100 nt od 5'-konca genoma med vodilnim zaporedjem (angl. »leader sequence«) in ORF1ab. Zaporedja TRS-B (angl. »body«) pa najdemo pred vsakim od strukturnih genov. Osrednji del vseh TRS-jev predstavlja 6-7 nt dolgo ohranjeno zaporedje CS (angl. »core sequence«). Ugotovili so, da nukleotidi na 5'- in 3'-koncih CS sodelujejo pri uravnavanju transkripcije. Dolžine TRS ter konsenzna zaporedja CS-L in CS-B so ohranjena znotraj posamezne vrste koronavirusov.  

Začetek diskontinuirne sinteze (-)sgRNA je enak kot pri replikaciji. RTC potuje od 3'- proti 5'-koncu genoma in sintetizira negativno verigo. Ko doseže TRS-B pred enim izmed genov, najprej prepiše 3'-končne nukleotide ter CS-B, ki predstavlja atenuacijski signal za RTC. Posledica je zamenjava matrice pod pogojem, da je dosežena minimalna vrednost -ΔG za sparjenje med cCB-B in CS-L. RTC skupaj s sintetizirano negativno verigo nato oddisocira od (+)gRNA ter se premakne na 5'-konec genoma, kjer se donorsko zaporedje cCS-B spari s akceptorskim CS-L. V nadaljevanju sinteze se na koncu vsake (-)sgRNA doda vodilno zaporedje. Tako iz enega virusnega genoma dobimo nabor različno dolgih (-)sgRNA, ki predstavljajo matrice za sintezo (+)sgmRNA. Pri diskontinuirni transkripciji genoma SARS-CoV-2 nastane osem sgmRNA, strukturno policistronskih, ker zapisujejo za več genov, dejansko pa se prevede le prvi ORF, zapisan za vodilnim zaporedjem na 5'-koncu vsake sgmRNA. 

Koliko (-)sgRNA pri transkripciji nastane določa več kriterijev. V okviru TRS je najpomembnejša stabilnost povezave (-ΔG) med TRS-L in TRS-B. Ugotovili so, da imajo glavno vlogo pri tem po štirje nukleotidi, ki se nahajajo neposredno ob CS-L in CS-B, ker prispevajo k komplementarnosti regij TRS-L in TRS-B ter stabilizaciji. Na količino nastale sgmRNA vplivajo predvsem nukleotidi na 3'-koncu, ker se prepišejo pred terminacijo. 

==Sekundarna struktura== 

Ker so zaporedja CS-L in CS-B identična nukleotidna zaporedja, za specifičnost vezave cTRS-B na TRS-L skrbi sekundarna struktura. Pri TGEV TRS-L tvori dve zanki, apikalno, ki vsebuje večino motiva CS-L, in notranjo, ki vpliva na temperaturo tališča. Za normalen potek transkripcije sta nujni optimalna struktura zanke, ki omogoča izpostavljenost zaporedja CS-L, in njena stabilnost, ki igra pomembno vlogo pri zamenjavi matric. 

==RNA-RNA interakcije== 

Za potek diskontinuirne transkripcije so poleg TRS-L in TRS-B zelo pomembne RNA-RNA povezave med oddaljenimi nukleotidi, ki so odvisne od nukleotidnega zaporedja in tvorbe sekundarnih struktur.  

Primer eksperimentalno dokazane regulacije transkripcije s pomočjo interakcij med zaporedji RNA je regulacija N sgmRNA pri prenosljivem koronavirusu gastroenteritisa (TGEV) [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6025776/figure/F2/]. Pri tem virusu je količina mRNA za sintezo nukleokapsidnega proteina za razliko od ostalih sgmRNA, ki so odvisne predvsem od ΔG, uravnavana drugače in je kljub nizki vrednosti ΔG prisotna v veliki količini. Najprej nastane povezava med bližnjim (pE) in oddaljenim elementom (dE), ki se nahajata pred TRS-B, in povzroči premik aktivne domene (AD, nahaja se pred dE). Na transkripcijo vpliva preko komplementarnosti zaporedij in medsebojne oddaljenosti (približno 450 baznih parov); bolj kot sta zaporedji komplementarni in bližje kot sta, več N sgmRNA nastane.  

Druga, bolj impresivna povezava, nastane med B motivom v aktivni domeni (B-M) in njemu komplementarnem zaporedjem (cB-M), ki sta več kot 26000 baznih parov narazen, kar je najdaljša znana povezava pri RNA virusih. Obe povezavi najverjetneje omogočata približanje TRS-L in TRS-B ter posledično uspešen 'skok', prav tako pa predvidevajo, da je nastali kompleks pomemben za upočasnitev oz. ustavitev sinteze nastajajoče (-)RNA, ki omogoča zamenjavo matrice. To teorijo podpirajo rezultati za TBSV (virus grmičave pritlikavosti paradižnika), kjer so dokazali, da RNA-RNA interakcije povzročijo ustavitev transkripcije. Oboje, tako nukleotidna zaporedja kot nastale sekundarne strukture, je zelo dobro ohranjeno med vsemi alfakoronavirusi I, iz česar sklepajo, da se N sgmRNA uravnava na podoben način. 

==RNA-protein interakcije== 

Poleg tega, da je sinteza N proteina regulirana z RNA-RNA interakcijami, pri tem sodelujejo tudi sami, in sicer kot RNA-šaperoni v obliki dimera, kar je bilo dokazano za TGEV in SARS-CoV in vitro. Imajo za RNA-šaperone značilno intrinzično neurejeno strukturo in s svojim delovanjem zmanjšajo energijo, potrebno za »skok« iz ene matrice na drugo. N-končni domeni (NTD) N proteina se vežeta na TRS-B in cTRS-B ter sprožita prekinitev obstoječih interakcij (TRS-B – cTRS-B) in nastanek novih (cTRS-B – TRS-L), za C-končni domeni (CTD) pa predvidevajo, da z vezavo na RNA stabilizirata protein. 

==Iniciacija sinteze RNA== 

Iniciacija sinteze RNA poteče na 3'-koncu (+)gRNA. Pri njej imajo vlogo sekundarne RNA strukture v neprevajajoči regiji 3' konca. Neprevajajoča regija vsebuje dve ključni zanki, izbočeno stebelno zanko (BSL) in lasnično zanko, ki zaradi komplementarnosti lahko tvorita strukturo psevdovozla. Slednji je RNA struktura, ki je predlagana z raziskavami in silico, ter načrtnim, ekstenzivnim mutiranjem na primeru mišjega koronavirusa (MHV). Ker psevdovozel ni rigiden in je energijsko neugodna konformacija, ima predlagano cis-aktivnost molekularnega stikala. Za iniciacijo je pomembno zaporedje 29 nukleotidov in  tudi poli(A) rep. To regulatorno zaporedje je primarno vezano v vijačno strukturo s komplementarno regijo zanke 1 (L1), ki je ključen del psevdovozla. Ko je BSL popolnoma pokončna in 3' konec sparjen z regijo L1 je struktura v optimalnem energijskem stanju. Vezavo med 3' koncem in L1 razdre kompleks ne-strukturnih proteinov 7-10, ki je odgovoren za sintezo začetnega oligonukleotida, saj ima predlagano primazno aktivnost. Po cepitvi teh dveh verig se prosta L1 oblikuje v psevdovozel, BSL pa se delno zamakne in tvori interakcije z lasnično zanko. RTC, ki ima podenoto z RdRp aktivnostjo (nsp12), ima afiniteto do nastale strukture. Ob vezavi RTC na 3' konec z že sintetiziranim začetnim zaporedjem, lahko RdRp nadaljuje s sintezo negativne RNA proti 5' koncu. Model iniciacije je trenutno še slabo definiran, eno od vprašanj, ki še ostaja, je ali 5' konec, ki je ob iniciaciji najverjetneje v neposredni bližini, prispeva k procesu. 

==Predlagana modela diskontinuirne sinteze RNA== 

Za potek diskontinuirne sinteze RNA sta bila predstavljena dva nasprotujoča si modela: model diskontinuirne sinteze s podaljšanjem negativnih RNA zaporedij in model transkripcije z vodilnim zaporedjem v vlogi začetnika sinteze RNA. Ključna razlika med njima je, da so v prvem sintetizirane negativne subgenomske v drugem pa pozitivne subgenomske RNA. Danes eksperimentalni podatki potrjujejo prvi model, torej sintezo negativnih subgenomskih RNA.  

Model diskontinuirne sinteze s podaljšanjem negativnih RNA ima tri ključne kriterije: bližina 5' ter 3' konca genomskega zaporedja, interakcija med jedrnimi zaporedji s pražno prosto entalpijo ter ključne interakcije proteinov med seboj in z matrično verigo. Prvi korak v modelu transkripcije je nastanek protein-RNA kompleksov na 5' in 3' koncih, združenje obeh koncev in sledeča iniciacija sinteze. Ko poteka prepis RNA, se 5' konec z vodilnim jedrnim zaporedjem premika po verigi in tvori interakcije z nastajajočo verigo, ki je v transkripcijskih regulatornih mestih komplementarna. Med TRS-L in TRS-B, se tvorijo bazni pari in ko je energija teh dovolj ugodna, se zgodi preskok replikacijsko-translacijskega kompleksa na 5' konec. Preskok se zgodi po koncu komplementarnosti nastajajočega zaporedja ter TRS-L. Nato se sintetizira 5' konec, ki je tipičen za vse subgenomske RNA, ki nastanejo pri koronavirusih z diskontinuirno sintezo.

==Viri==

I. Sola, F. Almazán, S. Zúñiga, L. Enjuanes: Continuous and Discontinuous RNA Synthesis in Coronaviruses. Annu Rev Virol 2015, 2, 265–288.
 
I. Sola, J. L. Moreno, S. Zúñiga, S. Alonso, L. Enjuanes: Role of Nucleotides Immediately Flanking the Transcription-Regulating Sequence Core in Coronavirus Subgenomic MRNA Synthesis. J Virol 2005, 79, 2506–2516.
 
I. Sola, P. A. Mateos-Gomez, F. Almazan, S. Zuñiga, L. Enjuanes: RNA-RNA and RNA-Protein Interactions in Coronavirus Replication and Transcription. RNA Biol 2011, 8, 237–248.
 
R. Züst, T. B. Miller, S. J. Goebel, V. Thiel, P. S. Masters: Genetic Interactions between an Essential 3′ Cis-Acting RNA Pseudoknot, Replicase Gene Products, and the Extreme 3′ End of the Mouse Coronavirus Genome. J Virol 2008, 82, 1214–1228.
 
N. E. Grossoehme, L. Li, S. C. Keane, P. Liu, C. E. Dann, J. L. Leibowitz, D. P. Giedroc: Coronavirus N Protein N-Terminal Domain (NTD) Specifically Binds the Transcriptional Regulatory Sequence (TRS) and Melts TRS-CTRS RNA Duplexes. J Mol Biol 2009, 394, 544–557.