View source for PHOCUS: Insekticid proti kobilicam na osnovi bakteriofagov

PHOCUS je projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, s katerim je ekipa podiplomskih študentov iz Delfta na Nizozemskem osvojila prvo mesto na področju Hrana.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:TUDelft

Avtor povzetka: Matija Ruparčič

== Problem ==
Puščavske kobilice (''Schistocerca gregaria'') običajno živijo samotarsko, med sušnimi obdobji pa se ob iskanju hrane združijo skupaj. Ko gostota združbe preseže kritično mejo, preidejo kobilice iz neškodljivega samotarskega fenotipa (solitaria) v črednega (gregaria), pri čemer se jim spremenijo morfologija, vedenjski vzorci in prehranske navade [1]. V čredni obliki se puščavske kobilice zbirajo v rojih, ki lahko štejejo tudi do 8 milijonov osebkov; tak roj v dnevu poje enako količino hrane kot 3,5 milijona ljudi [2].

Zaradi neizmerne škode, ki jo roji kobilic povzročajo vsako leto na območju Severne Afrike, Arabskega polotoka in Južne Azije, je obvladovanje njihovega števila ključnega pomena. Za to sta na voljo dva pristopa, kemični ter biološki pesticidi, ki pa imata oba svoje pomanjkljivosti; kemični pesticidi so sicer učinkoviti, vendar nespecifični, medtem ko so biološki pesticidi sicer specifični, a delujejo prepočasi za uporabo ob nenadnih izbruhih [2, 3].

== Projekt PHOCUS ==

=== Ideja ===
Ideja projekta je bila zasnovati nov biološki pesticid, ki je še vedno specifičen, obenem pa deluje hitreje kot trenutni. Ekipa iz Delfta se je odločila uporabiti rekombinantne bakteriofage z zapisi za toksine, ki delujejo le na kobilicah. Ob zaužitju poškropljene hrane pridejo fagi v črevo kobilic, kjer okužijo bakterije črevesne flore. Tekom okužbe pričnejo le-te sintetizirati, nove bakteriofage, ki po lizi okužijo sosednje bakterije, in toksine, ki se ob lizi sprostijo v lumen črevesa in povzročijo smrt kobilice [4].

Končni izdelek naj bi vseboval koktejl litičnih fagov, ki okužijo več vrst bakterij iz rodu ''Enterobacter''; ta namreč predstavlja velik delež mikrobioma puščavskih kobilic [5].

=== Princip delovanja ===
Ekipa je zasnovala PHOCUS tako, da povzroči smrt kobilic na dva načina, in sicer preko (1) insekticidne aktivnosti toksina Cry7Ca1 ter (2) preko utišanja genov z RNA interferenco (RNAi).

Cry7Ca1 je endotoksin delta, ki ga ob sporulaciji proizvaja bakterija Bacillus thuringiensis (sev BTH-13). Mehanizem delovanja še ni popolnoma znan; predvideva se, da se aktivni toksin specifično veže na receptor na membrani črevesnih celic in povzroči tvorbo ionskega kanalčka, kar privede do celične lize ter s tem do poškodbe črevesa [4]. Tako kot ostali endotoksini delta iz B. thuringiensis ima tudi Cry7Ca1 omejen spekter delovanja; pri kobilicah Locusta migratoria manilensis izkazuje visoko insekticidno aktivnost, medtem ko je neškodljiv za metulje, hrošče in dvokrilce [6].

Rekombinantni fagi naj bi poleg zapisa za toksin vsebovali še zapis za kratko lasnično RNA (shRNA). Ta bi se na koncu litičnega cikla prav tako sprostila v lumen črevesa, nato pa bi prešla v hemolimfo in z tam v celice, kjer bi ob procesiranju z endonukleazo DICER dozorela v siRNA. Slednja nato lahko tvori kompleks RISC, ki utiša tarčne gene, kar privede bodisi do smrti bodisi do neplodnosti kobilice [4, 7]. Prehod shRNA iz lumna črevesa v hemolimfo je lahko dodatno olajšana z uporabo dostavljalnega proteina, ki vsebuje regijo, ki se specifično veže na shRNA; primer take regije je RNA-vezavna domena (RBD) iz proteina Fox-1 [8].

== Eksperimentalno delo ==
Zaradi pandemije COVID-19 ekipi ni uspelo sestaviti in ovrednotiti delovanje PHOCUS, vendar pa so uspešno pripravili 10 osnovnih ter 9 sestavljenih bioloških delov, s katerimi so okarakterizirali posamezne komponente insekticida. Pri eksperimentih so uporabljali bakterije ''Escherichia coli'' BL21(DE3) ter bakteriofage T7.

=== Priprava rekombinantnih fagov ===
Rekombinantne fage T7 so pripravili s pomočjo homologne rekombinacije, in sicer z metodo BRED (angl. Bacteriophage Recombineering of Electroporated DNA) [9].

Znotraj fagne DNA so izbrali tri neesencialne gene, ki so jih želeli zamenjati z reporterskim genom (eGFP), in sicer: 0,6A in 1,1 (zgodnja gena) ter 4,3 (srednji gen). Vključek so pripravili tako, da so s PCR pomnožili zapis za eGFP ter mu preko previsov na vsako stran dodali 100 bp zaporedje, ki je bilo homologno tarčnemu genu na fagu. Z vključkom so nato preko elektroporacije transformirali ''E. coli'' BL21(DE3) in jih nato okužili s fagi T7. Ob vstopu fagne DNA v celico je prišlo do homologne rekombinacije z vključkom, pri čemer je nastala rekombinantna fagna DNA [9].

Bakterije so pred tem transformirali še s plazmidi pKDsgRNA, ki so vsebovali vodilno RNA (sgRNA) za enega izmed treh neesencialni fagni gen, in pCas9-CR4, ki je vseboval zapis za endonukleazo Cas9. Kompleks sgRNA-Cas9 prepozna tarčno zaporedje na fagni DNA divjega tipa (wt) in ga cepi, s čimer se zmanjša število novonastalih wt fagov.

=== Karakterizacija RNAi ===
Tekom karakterizacije RNAi komponente so jih zanimale tri stvari:
* Ali lahko z RNA-polimerazo T7 pridobijo shRNA s pravilno sekundarno strukturo in vitro?
* Ali se domena RBD iz proteina Fox-1 veže specifično na lasnično zanko shRNA?
* Ali predstavlja shRNA dober substrat za endonukleazo DICER?

In vitro translacijo s polimerazo T7 so izvedli s pomočjo kompleta reagentov T7 RiboMAX RNAi express kit (Promega). Uporabili so shRNA, ki je sestavljena iz: i) prepoznavnega zaporedja za eGFP, ii) zavoja, ki ga prepozna Fox-1 in iii) previsa GG na 3'-koncu ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407006 BBa_K3407006]) ter jo vstavili pod promotor T7 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407022 BBa_K3407022]). Sintetizirane shRNA so analizirali na Urea-PAGE.

Vezavo domene RBD iz Fox-1 na shRNA so preverjali s testom zamika elektroforezne mobilnosti (EMSA). ''E. coli'' BL21(DE3) so transformirali s prej omenjeno shRNA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407022 BBa_K3407022]) ter Fox-1 RBD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407020 BBa_K3407020]) v molarnih razmerjih 1:1 ter 1:2. Eksperiment so ponovili še dvakrat; prvič so uporabili mutirano obliko Fox-1 RBD, ki naj bi imela nižjo afiniteto do shRNA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407024 BBa_K3407024]), drugič pa z shRNA, ki ima dve mutaciji na zavoju ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407023 BBa_K3407023]) vzorce so analizirali na nativnem PAGE.

Ali bi DICER iz kobilic prepoznal ter procesiral shRNA do siRNA so preverili s tem, da so 400 ng shRNA inkubirali pri 25°C v pufru, ki je vseboval 0,2 µM DICER iz ''Drosophila melanogaster''. Po določenem času (1-5 h) so reakcijo prekinili s tekočim dušikom in vzorce analizirali na Urea-PAGE.

=== Matematični model ===
Delovanje PHOKUS so testirali s pomočjo matematičnega modela, ki so ga priredili po že obstoječem, ki sta ga zasnovala Beretta in Kuang [10]. Model vsebuje štiri spremenljivke: i) koncentracija zdravih bakterij, ii) koncentracija okuženih bakterij, iii) koncentracija fagov in iv) koncentracija toksinov ter spremlja spreminjanje le-teh skozi čas; pri tem upošteva iz eksperimentov/literature pridobljene parametre (npr. hitrost rasti in lize bakterij, maksimalna kapaciteta bakterij, hitrost propadanja fagov itd.). Model so kasneje dopolnili še z dodatnim korakom, kjer so upoštevali razvoj rezistence na fage. Model so evalvirali tako, da so bakterije E. coli okužili s fagi T7 in merili časovno odvisnost OD<sub>600</sub> bakterij ter časovno odvisnost koncentracije fagov.

== Rezultati ==
Ekipi je tekom priprave rekombinantnih fagov T7 uspelo zamenjati vse tri neesencialne gene z metodo BRED, vendar so pri genih 0,6A in 1,1 opazili še neželene produkte, zato so v nadaljevanju uporabljali fage z zamenjanim genom 4,3. Kljub uporabi sistema CRISPR-Cas9 jim rekombinantnih fagov ni uspelo izolirati, saj so plaki še vedno vsebovali fage divjega tipa.

Tekom karakterizacije RNAi komponente so ugotovili, da lahko polimeraza T7 uspešno prepiše zapis za shRNA in vitro; prepisana shRNA pri tem tudi zavzame pravilno sekundarno strukturo (lasnična zanka). Eksperimenti z metodo EMSA so pokazali, da se RBD Fox-1 lahko veže tako tarčno kot tudi na mutirano shRNA, medtem ko se mutirana domena ne veže na nobeno. Domena se veže močneje pri molarnem razmerju 1:2. Ugotovili so tudi, da DICER iz ''D. melanogaster'' prepozna in procesira shRNA do siRNA, kar nakazuje, da je ima uporabljena shRNA potencial za utišanje genov kobilic v procesu RNAi.

Simulacije z matematičnim modelom so pokazale, da lahko insekticid proizvede zadostno količino toksinov, ki povzroči smrt osebkov v manj kot 7 dneh; hitrost razvoja rezistence na fage je prepočasna, da bi bistveno vplivala na produkcijo toksinov. Evalvacija modela je pokazala, da uporabljene enačbe in parametri odražajo realno stanje sistema.

== Zaključek ==
Na tekmovanju iGEM 2020 je na področju Hrana zmagala skupina študentov iz UT Delft. Pripravili so insekticid z imenom PHOKUS, ki temelji na uporabi rekombinantnih bakteriofagov, ki okužijo črevesno floro kobilic ter povzročijo sintezo toksina Cry7Ca1 ter shRNA. Uspelo jim je okarakterizirati posamezne komponente insekticida, z matematičnim modelom pa jim je uspelo dokazati, da lahko insekticid ubije kobilice v dovolj hitrem času.

Pred uporabo v praksi bi bilo treba opraviti še naslednje stvari:
* Preveriti toksičnost Cry7Ca1 za Schistocerca gregaria 
* Priprava dostavljalnega proteina za olajšan transport shRNA iz lumna črevesa v hemolimfo
* Preizkusiti prepisovanje več shRNA v tandemu (tshRNA) in procesiranje le-te do posameznih shRNA z encimom Mini-3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407018 BBa_K3407018])
* Preizkusiti koekspresijo shRNA z inhibitorji RNaz

== Viri ==
#   D. A. Cullen, A. J. Cease, A. V. Latchininsky, A. Ayali, K. Berry, J. Buhl, R. De Keyser, B. Foquet, J. C. Hadrich, … S. M. Rogers: From Molecules to Management: Mechanisms and Consequences of Locust Phase Polyphenism. 1. izd., Elsevier Ltd. 2017, Let. 53.
#   A. Roussi: Why gigantic locust swarms are challenging governments and researchers. Nature 2020, 579(7799), str. 330–330.
#   L. Zhang, M. Lecoq, A. Latchininsky, D. Hunter: Locust and Grasshopper Management. Annu. Rev. Entomol. 2019, 64(1), str. 15–34.
#   TU Delft iGEM Team https://2020.igem.org/Team:TUDelft (pridobljeno 19. 5. 2021).
#   O. Lavy, U. Gophna, E. Gefen, A. Ayali: The effect of density-dependent phase on the locust gut bacterial composition. Front. Microbiol. 2019, 10(JAN), str. 1–8.
#   Y. Wu, C.-F. Lei, D. Yi, P.-M. Liu, M.-Y. Gao: Novel Bacillus thuringiensis δ-Endotoxin Active against Locusta migratoria manilensis. Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77(10), str. 3227–3233.
#   G. J. Hannon: RNA interference. Nature 2002, 418(6894), str. 244–251.
#   S. D. Auweter, R. Fasan, L. Reymond, J. G. Underwood, D. L. Black, S. Pitsch, F. H.-T. Allain: Molecular basis of RNA recognition by the human alternative splicing factor Fox-1. EMBO J. 2006, 25(1), str. 163–173.
#   L. J. Marinelli, M. Piuri, Z. Swigoňová, A. Balachandran, L. M. Oldfield, J. C. van Kessel, G. F. Hatfull: BRED: A Simple and Powerful Tool for Constructing Mutant and Recombinant Bacteriophage Genomes. PLoS One 2008, 3(12), str. e3957.
#   E. Beretta, Y. Kuang: Modeling and analysis of a marine bacteriophage infection. Math. Biosci. 1998, 149(1), str. 57–76.