View source for AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi

AptaVita je projekt študentov iz tehniške univerze v Delftu, ki je na tekmovanju iGEM 2021 zasedel drugo mesto med projekti podiplomskih študentov ter zmagal v kategorijah diagnostika in podjetništvo. Cilj skupine je bil pripraviti hitri diagnostični test za detekcijo pomanjkanja vitamov. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:TUDelft iGEM:TU Delft]

==Problem: skrita lakota==
Mikrohranila so vitamini in minerali, ki jih telo potrebuje v zelo majhnih količinah. Njihov vpliv na zdravje je ključnega pomena, njihovo pomanjkanje pa lahko povzroči huda in celo življenjsko nevarna stanja [1]. Pomanjkanje mikrohranil, za katerega se uporablja tudi izraz skrita lakota, je pomemben zdravstveni problem, ki lahko povzroči slabši telesni in duševni razvoj otrok, ranljivost ali poslabšanje bolezni, duševno zaostalost in slepoto [2]. Po ocenah Svetovne zdravstvene organizacije je skrita lahkota prizadela več kot dve milijardi ljudi po vsem svetu, zlasti v državah z nizkimi in srednjimi dohodki. Uspešna strategija za spopadanje s skrito lakoto mora biti trajnostna, stroškovno učinkovita in sposobna prinesti koristi v najbolj oddaljene in marginalizirane skupinosti [3]. Trenutno se za detekcijo ravni mikrohranil uporabljajo kvantitativni laboratorijski testi, kot sta tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) in masna spektrometrija (MS). Te diagnostične tehnike so drage in zahtevajo usposobljeno osebje, zaradi česar niso dostopne večini držav z nizkimi dohodki [4].

==Ideja: AptaVita==
AptaVita je nov modularni biosenzor, ki omogoča diagnostiko pomanjkanja vitaminov iz krvi, kar pripomore k spopadanju s skrito lakoto in povečanju razpoložljivih baz podatkov o pomanjkanju mikrohranil. Delovanje AptaVite temelji na uporabi aptacimov, ki so integrirani v genetsko vezje z reporterskim genom, ki se izraža v brezceličnem sistemu. Encimska aktivnost proteina, ki ga kodira reporterski gen, povzroči spremembo barve subsrata na papirnati podlagi, ki se nato kvantificira in inerpretira s prenosno opremo [4].

==Aptacimi==
Aptacimi so sintetične RNA molekule, ki združujejo lastnosti aptamerov in ribocimov. Vsebujejo domeno, ki veže majhno molekulo, protein ali kovinski ion in zaporedje ribocima, ki cepi samega sebe. V projektu so izkoristili lastnost ribocimov, da se cepijo samo v odsotnosti liganda. V prisotnosti liganda pa se le ta veže na specifično zaporedje znotraj velike zanke aptacima, kar vpliva na interakcije z manjšo zanko in s tem ovira samocepitev [4].  

===DRIVER===
Za iskanje ustreznih aptacimov so uporabili metodo ''de novo'' hitrega ''in vitro'' razvoja RNA-biosenzorjev (DRIVER) [4]. 

Metoda DRIVER se začne s sintezo visoko raznolike knjižnice potencialnih biosenzorjev. Med krogi, v katerih so prisotni ligandi, nerazcepljene molekule RNA ohranijo nespremenjeno zaporedje predpone iz prejšnjega kroga. Ta RNA-zaporedja se pomnožijo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki se vežeta na ohranjeno predpono in obrazilo. Med krogi, v katerih tarčni ligandi niso dodani, se molekule RNA, ki se samorazcepijo, regenerirajo z dodatkom druge predpone. Nato ponovno poteče pomnoževanje s PCR, vendar se uporabijo začetni oligonukleotidi, ki se vežejo na novo predpono in obrazilo. Z večkratno ponovitvijo tega postopka vsak krog selektivno obogati želeno podmnožico zaporedij iz knjižnice. Sčasoma v populaciji prevladujejo zaporedja RNA, katerih cepitev uravnavajo tarčni ligandi. Po številnih krogih selekcije se s pomočjo sekvenciranja nove generacije (NGS) v knjižnicah določijo zaporedja, ki se cepijo v odsotnosti liganda in ostanejo necepljena v njegovi prisotnosti [4, 5]. 
====Izvedba====
Izvedbo DRIVER so začeli s sintezo dveh knjižnic s potencialnimi biosenzorji. Kot osnovo so uporabili zaporedje sTRSV ribocima (satellite RNA of the tobacco ringspot virus (sTRSV)), dve zanki katerega sta bili naključno spremenjeni in podaljšani. Prvo knjižnico so sestavljala zaporedja s 30 nukleotidov dolgo veliko zanko (N30). Druga knjižnica je vsebovala zaporedja s 60 nukleotidov dolgo veliko zanko (N60) [4]. 

Skupina se je odločila, da bo ločeno izvajala iskanje aptacimov, ki se specifično vežejo na folat (vitamin B9), in aptacimov za vezavo mešanice vitaminov. Na podlagi združljivosti pufrov in razširjenosti pomanjkanja vitaminov so izbrali naslednje vodotopne vitamine: tiamin pirofosfat (B1), riboflavin (B2), piridoksal 5′-fosfat (B6) in kobalamin (B12). Tako so dobili štiri vzorce za iskanje primernih aptacimov [4].

V projektu so začeli z dvema krogoma brez liganda, da so odstranili zaporedja, ki se ne cepijo. Sledilo je 60 izmenjajočih se krogov v prisotnosti liganda in njegovi odsotnosti. Ker so poskus izvajali ročno, so za potrditev prisotnosti produktov transkripcije po vsakem krogu izvedli Urea-PAGE. Ravno s pomočjo Urea-PAGE so zaznali, da so se knjižnice N60 postopoma izgubili in po 43 krogih selekcije ni bilo prisotne nobene lise, zato so poskus nadaljevali s knjižnico N30. Verjetno je podaljšanje velike zanke povzročilo veliko spremembo strukture aptacima, ki je ovirala samocepitev in s tem proces selekcije [4]. 

Od vseh kandidatov so kot potencialne aptacime izbrali dve zaporedji iz vzorca z dodanim folatom in tri iz vzorca z vitaminsko mešanico. Prvi kandidat iz vzorca s folatom je pokazal 2,56-kratno razliko v prisotnosti med vzorcem z ligandom in vzorcem brez liganda. Ostala zaporedja pa so pokazala spremembo manjšo od 2-krat. Majhno razliko bi lahko razložili z omejenim številom krogov (63), ki so jih izvedli [4]. 

==Genetsko vezje==
Zasnovali so genetsko vezje, v katerem je izražanje reporterskega gena odvisno od dostopnosti vezavnega mesta za ribosom (RBS). Konstrukt je modularen in lahko služi kot predloga za oblikovanje drugih vezij, specifičnih za določen ligand, z zamenjavo aptacimske domene. Kot reporterski gen so izbrali gen ''lacZ'', ki kodira encim β-galaktozidazo. β-galaktozidaza cepi substrat klorofenol rdeče β-D-galaktopiranozid (CPRG) v klorofenol rdeče (CPR), kar zaznamo kot spremembo barve iz rumene v rdečo. Ob vezavi liganda se aptacim stabilizira in RBS ostane v celoti vezan na protismiselno verigo, kar onemogoči prevajanje. Cepitev aptacima v odsotnosti liganda sprosti RBS in se ribosom lahko veže na RBS, kar privede do cepitve substrata in nastanka CRP [4]. 

Pripravljeno genetsko vezje ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806014 BBa_K3806014)] je bilo sestavljeno iz:

•	T7 promotorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3633015 BBa_K3633015])

•	cRBS: teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806010 BBa_K3806010])

•	reporterskega gena ''lacZ'' z optimizirano rabo kodona za E.coli ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806012 BBa_K3806012])

•	3' UTR ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806013 BBa_K3806013])

•	T7 terminatorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K395601 BBa_K395601]).

Ustvarjen konstrukt so uspešno izrazili v brezceličnih sistemih PURExpress in PUREFrex2.0, ki sta različici sistema za sintezo proteinov z uporabo rekombinantnih elementov (PURE) [6]. Osnovne komponente sistema PURE so RNA polimeraza iz bakteriofaga T7, 70S ribosom iz E. coli, molekule tRNA, 31 translacijskih faktorjev ter pufer, ki vsebuje tRNA, NTP, aminokisline, DTT in številne druge komponente [7]. Stopnja izražanja reporterskega gena je bila v primerjavi s kontrolnim konstruktom brez aptacimskega stikala nizka, zato so domnevali, da čeprav se aptacim cepi, protismiselni fragment ostane vezan na RBS, kar ovira translacijo. Kot pozitivno kontrolo so uporabljali biokocko [http://parts.igem.org/Part:BBa_I732017 BBa_I732017] z zapisom za gen lacZ, ki so ji dodali T7 promotor [4].

Da bi izboljšali izražanje, so zasnovali nov konstrukt ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3806016 BBa_K3806016]), v katerem so uporabili drugo zaporedje teofilin-vezavnega aptacima obdanega z RBS in anti-RBS (BBa_K3806015), semi-cRBS. Zaporedje protismiselne verige so spremenii tako, da je bilo samo devet nukleotidov, vključno s štirimi nukleotidi RBS, komplementarnih protismiselni verigi, kar naj bi izboljšalo ločitev protismiselne verige od RBS. Oba konstrukta, cRBS in semi-cRBS, so izrazili v odsotnosti in prisotnosti teofilina v sistemu PURExpress z uporabo CPRG kot substrata [4]. Nastajanje produkta so določili z merjenjem absorbance pri 575 nm. Meritve so pokazali, da je bil konstrukt semi-cRBS bolje izražen kot začetni konstrukt cRBS. Pri uporabi konstrukta semi-cRBS so opazili večji dinamični razpon in hitrejši odzivni čas. Poleg tega v skladu s pričakovanji je prisotnost teofilina v obeh modelih povzročila zmanjšanje izražanja. Dodatek 5 mM teofilina je po 1,5 urah izražanja povzročil 33,3% zmanjšanje izražanja pri semi-cRBS, v nasprotju s 6,1 % zmanjšanjem pri cRBS, kar potrjuje izboljšan odzivni čas sistema pri uporabi semi-cRBS [4].

==Liofilizirana brezcelična papirnata ekspresijska platforma za diagnostiko==
Skupina je želela razviti komplet za merjenje koncentracije vitaminov, ki je neodvisen od hladne verige, zato so se odločili za liofilizacijo komponent, potrebnih za detekcijo. Tri komponente: plazmid, ki vsebuje konstrukt aptacima in reporterskega gena, brezcelični sistem PURE in rumeni substrat CPRG so liofilizirali na papirnatih diskih [4]. 

Po 5 dneh shranjevanja pri sobni temperaturi so papirnate diske rehidrirali z vodo ali teofilinom in inkubirali pri 37 °C 24 ur. Neposredno po rehidraciji niso opazili spremembe barve. Po 24 urah pa je bila opazna rahla sprememba barve iz rumene v oranžno na disku, ki je bil rehidriran z vodo in vseboval semi-cRBS genetski konstrukt [4]. Zmerna sprememba barve je verjetno posledica izgube encimske aktivnosti med postopkom liofilizacije, saj je test brez koraka liofilizacije pokazal močno spremembo barve v odsotnosti teofilina [4]. 

==Strojna oprema==
Zadnji korak v načrtovanju je bil povezava meritve absorbance s koncentracijo vitamina. Zasnovali so strojno opremo, ki omogoča izražanje in merjenje absorbance. Zaprta škatla omogoča izražanje pri konstantnih 37 °C in ščiti papirnate diske, na katerih poteka izražanje, pred svetlobnim onesnaževanjem. Škatla vsebuje LED diode, ki oddajajo svetlobo v območju 550-600 nm z vrhom pri 574 nm. To ustreza vrhu absorpcije CPR, ki jo odčitajo svetlobni senzorji znotraj naprave. Meritve so pokazle, da je naprava sposobna razlikovati med različnimi koncentracijami CPR [4].

==Viri==
1.	Micronutrients https://www.who.int/health-topics/micronutrients#tab=tab_1 (pridobljeno 10. 4. 2022).

2.	Micronutrient Deficiency - Our World in Data https://ourworldindata.org/micronutrient-deficiency#licence (pridobljeno 9. 4. 2022).

3.	N. M. Lowe: The global challenge of hidden hunger: Perspectives from the field. In: Proceedings of the Nutrition Society. Cambridge University Press 2021, Vol. 80, pp. 283–289.

4.	Team:TUDelft - 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:TUDelft (pridobljeno 9. 4. 2022).

5.	B. Townshend, J. S. Xiang, G. Manzanarez, E. J. Hayden, C. D. Smolke: A multiplexed, automated evolution pipeline enables scalable discovery and characterization of biosensors. Nat. Commun. 2021, 12(1).

6.	A. Doerr, E. De Reus, P. Van Nies, M. Van Der Haar, K. Wei, J. Kattan, A. Wahl, C. Danelon: Modelling cell-free RNA and protein synthesis with minimal systems. Phys. Biol. 2019, 16(2).

7.	Y. Shimizu, A. Inoue, Y. Tomari, T. Suzuki, T. Yokogawa, K. Nishikawa, T. Ueda: Cell-Free Translation Reconstituted with Purified Components. , 2001.