View source for Razvijanje temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

Razvijanje temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

UVOD

Neurospora crassa je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je N. crassa pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov.  
Proteini toplotnega šoka (hsp) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo hsp, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je N. crassa.
Faktorji toplotnega šoka (hsf) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine hsp. Po oligomerizaciji se faktorji hsf vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (hse), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V N. crassi so opisali tri gene hsp (hsp30, hsp70 in hsp80), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne cis regulatorne elemente.
V N. crassa so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij.

Funkcijska analiza HSP promotorjev
V preteklih študijah so pri promotorju gena hsp30 definirali štiri regije hse, medtem ko so v promotorju hsp70 našli dve. Hsp70 ne vsebuje regulatornih elementov hse, vendar so opisane nekoliko različne cis regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (tre).
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih cis elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina) kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve glive in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem N. crasse (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero. 
Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri hsp30 in hsp70 odzivali v skladu s številom domnevnih hse regij, ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem hsp80 (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih tre regij), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja hse80. Izmed treh genov so pri hsp30 opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom). 
Hsp30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP hidrolazne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši hsp-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri hsp30.
Avtorji so hsp30 primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v N. crassa, kot sta promotor qa-2, ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor vvd, ki se aktivira s svetlobo. Promotor hsp30 je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od vvd promotorja (4 h ). 

Odziv HSP30 promotorja na toplotne dražljaje
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor hsp30. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne šoke pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu pcr mikrotitrske plošče in testirali 3 različne promotorje hsp30 (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (pcr mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni.
Konstrukti s promotorji hsp30 so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente hse), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom.
Temperaturno pogojena rast N crasse
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti N. crasse, saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih  genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev N. crasse, pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor hsp30 in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor hse30 vsebuje le dve od štirih domnevnih regij hse in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv hsp30 promotorja na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V N. crassi je namreč prisotna ponavljajoča inducirana mutacija (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA.
Rezultati so pokazali, da se sev hsp300.5 kb:clr-2 ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25°C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45°C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni.
Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih cis regij hsp30 
Da bi uporabili vse domnevne hse regije, in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije hse. S primerjavo promotorja hse30 s promotorji hse30 iz  sorodnih organizmov N. crasse so identificirali še peto regijo hse, ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami hse.
Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev [vir]. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev hsp70 in hsp80, prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja hsp30. Zaradi velike ohranjenosti promotorja hsp30 bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih Aspergillus niger ali Trichoderma reesei.




Zaključek
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [vir].
Ko so zapis za clr-2 postavili pod hse30 promotor, so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [vir].