View source for Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

Izhodiščni članek : [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03291-22: Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa]


== Uvod ==
''Neurospora crassa'' je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je ''N. crassa'' pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov [1].
  
Proteini toplotnega šoka (HSP) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo ''hsp'', še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je ''N. crassa''. Faktorji toplotnega šoka (HSF) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine HSP. Po oligomerizaciji se faktorji HSF vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (''hse''), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V ''N. crassi'' so opisani trije geni hsp (''hsp30'', ''hsp70'' in ''hsp80''), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne ''cis'' regulatorne elemente [1].

V ''N. crassa'' so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij [1].

== Funkcijska analiza promotorjev ''hsp'' ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena ''hsp30'' definirali štiri regije ''hse'', medtem ko so v promotorju ''hsp70'' našli dve. ''hsp70'' ne vsebuje regulatornih elementov ''hse'', vendar so opisane nekoliko različne ''cis'' regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (''tre'').
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih ''cis'' elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina), kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve plesni in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem ''N. crasse'' (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero [1]. 

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri ''hsp30'' in ''hsp70'' odzivali v skladu s številom domnevnih ''hse'' regij, ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem ''hsp80'' (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih regij ''tre''), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja ''hse80''. Izmed treh genov so pri ''hsp30'' opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom) [1]. 

''Hsp30'' ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP-hidrolizne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši HSP-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri ''hsp30''.
Avtorji so ''hsp30'' primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v ''N. crassa'', kot sta promotor ''qa-2'', ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor ''vvd'', ki se aktivira s svetlobo. Promotor ''hsp30'' je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od promotorja ''vvd'' (4 h) [1]. 

== Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor ''hsp30''. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne dražljaje pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu mikrotitrske plošče za PCR in testirali 3 različne promotorje ''hsp30'' (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (PCR mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni [1].

Konstrukti s promotorji ''hsp30'' so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente ''hse''), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom [1].

== Temperaturno pogojena rast ''N. crasse'' ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti ''N. crasse'', saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih  genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev ''N. crasse'', pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hsp30'' in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor ''hse30'' vsebuje le dve od štirih domnevnih regij ''hse'' in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V ''N. crassi'' so namreč prisotne ponavljajoče se inducirane točkovne mutacije  (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA [1].

Rezultati so pokazali, da se sev ''hsp300:clr-2'' ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25 °C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45 °C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni [1].

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih ''cis'' regij ''hsp30'' ==
Da bi uporabili vse domnevne regije ''hse'', in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije ''hse''. S primerjavo promotorja ''hse30'' s promotorji ''hse30'' iz  sorodnih organizmov ''N. crasse'' so identificirali še peto regijo ''hse'', ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami ''hse'' [1].

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev ''hsp70'' in ''hsp80'', prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja ''hsp30''. Zaradi velike ohranjenosti promotorja ''hsp30'' bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih ''Aspergillus niger'' ali ''Trichoderma reesei'' [1, 2].

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [1, 3].

Ko so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hse30'' , so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].

== Literatura ==

[1]	C. Tabilo-Agurto, V. Del Rio-Pinilla, V. Eltit-Villarroel, A. Goity, F. Muñoz-Guzmán, in L. F. Larrondo, „Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa“, mBio, let. 14, št. 1, str. e03291-22, feb. 2023, doi: 10.1128/mbio.03291-22.

[2]	J. Han, B. McLane, E.-H. Kim, J.-W. Yoon, in H.-S. Jun, „Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter“, Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther., let. 19, št. 3, str. 470–478, mar. 2011, doi: 10.1038/mt.2010.255.

[3]	J. Hearn, I. Ssinabulya, J. I. Schwartz, A. R. Akiteng, H. J. Ross, in J. A. Cafazzo, „Self-management of non-communicable diseases in low- and middle-income countries: A scoping review“, PLOS ONE, let. 14, št. 7, str. e0219141, jul. 2019, doi: 10.1371/journal.pone.0219141.

[4]	A. K. Chandel, C. Es, R. Rudravaram, M. L. Narasu, V. Rao, in P. Ravindra, „Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal“.