View source for Utišanje izražanja genov s strukturo definirano zankasto strukturo male nekodirajoče RNA s programiranimi regulatornimi aktivnostmi


== Uvod ==


Male regulatorne RNA (sRNA) imajo pomembno vlogo pri regulaciji genov na tak način, da se vežejo na tarčno mRNA. Eden izmed mehanizmov, preko katerega sRNA izvajajo svojo funkcijo, je tvorba baznih parov s komplementarno regijio na tarčni mRNA, kar vodi do utišanja izražanja gena. Sintetične sRNA so dizajnirali na način, da targetirajo in regulirajo izražanje genov, ki med seboj niso evolucijsko povezani oziroma si ne delijo skupnega prednika. Take sRNA načrtamo z zamenjavo komplementarne regije na naravni sRNA z zaporedjem, ki je komplementarno tem nesorodnim si genom. Kljub temu pa je načrtovanje lahko precej zahtevno, saj se naravna sRNA pogosto zvije v kompleksne sekundarne strukture, ki so pomembne za njeno stabilnost in funkcijo. Prav tako smo omejeni s številom naravnih sRNA, ki jih lahko uporabimo kot osnovo za načrtovanje novih molekul, zato se je pojavila potreba po razvoju algoritmov oziroma računalniških programov, ki bi nam pomagali premostiti ta problem. Ravno za ta namen v članku predstavijo program sslRNAD kot plod njihovega raziskovalnega dela.


== Trans delujoča mala nekodirajoča RNA ==


Trans-delujoča mala nekodirajoča RNA (angl. trans-acting small non-coding RNA, sRNA) je 50 – 300 nt dolga molekula, ki deluje kot pomemben post-transkripcijski regulator in sodeluje pri številnih fizioloških procesih npr. regulacija metabolizma, transport substratov in odgovor na stres, medtem ko pa se sama ne procesira post-transkripcijsko, zaradi daljšega zaporedja pa tvori komplicirane sekundarne strukture. Tip teh RNA se je v bakterijah razvil za regulacijo izražanja tarčnih genov kot odgovor na spremembe v okolju. Velik delež regulacije temelji na parjenju baz s tarčnimi mRNA. Za trans razred sRNA je značilno, da se prepišejo iz lokacije, ki je na genomu oddaljena od lokacije tarčnih genov, medtem ko je njim nasproten razred, ''cis''-sRNA, prepisan iz verige DNA, ki je komplementarna tisti, iz katere se prepiše tarčna RNA. Zato si tudi ''trans''-sRNA s tarčnimi mRNA deli nižji delež komplementarnosti v primerjavi s ''cis''-sRNA [1, 2]. 

Strukturno so pri sRNA okarakterizirali tri funkcionalne elemente: regijo, ki tvori bazne pare z mRNA, strukturo, ki veže Hfq in od rho neodvisen terminator. Protein Hfq je RNA-vezavni protein ima ključno vlogo pri post-transkripcijski regulaciji izražanja genov na tak način, da regulira nastanek interakcij med sRNA in njeno tarčno mRNA. Z obema omenjenima RNA tvori kompleks, hkrati pa deluje kot šaperon in preprečuje razgradnjo sRNA oziroma mRNA. Ta interakcija lahko potem rezultira v aktivaciji ali represiji izražanja tarčnega gena, glede na tip specifičnost parjenja sRNA in mRNA [3]. Od rho neodvisen terminator, naslednji funkcionalni element, je pri bakteriji ''E.coli'' dobro opisan način terminacije. Imenujemo ga tudi intrinzični terminator, vsem tem pa je skupna struktura lasnične zanke, ki je bogata z uracili (govorimo o poliU repu) in se nahaja na 3'-koncu RNA [4]. 

Uporaba sintetičnih sRNA je ustreznejša za represijo tarčnih genov, kadar le-ti ne morejo biti izbiti ali kadar je preferirano fino zniževanje ravni izražanja tega gena. Sintetična sRNa je narejena z modificiranjem regije, kjer pride do tvorbe baznih parov, saj je to eden izmed ključnih funkcionalnih elementov, odgovornih za vezavo sRNA na mRNA. Z modificiranjem te regije lahko do določene stopnje reguliramo stopnjo represije [1, 5]. 


== Rezultati ==


== Minimizacija ogrodja sRNA na eno samo zanko s poliU repom ==

Naravna sRNA se ponavadi zvije v zakomplicirane sekundarne strukture in sodeluje pri regulatornih aktivnostih, ki jih ne moremo nadzirati oziroma programirati. V članku so želeli predstaviti enostavno osnovno strukturo sRNA, ki so jo skrajšali le na nujne elemente. Postopno so predstavili različno dolge strukture, ki so jih po korakih krajšali in preverjali njihovo zmožnost represije [1].
Najprej so delo začeli s t.i. ''dolgo strukturo'', ki vsebuje nesparjeno z AU bogato škatlo, lasnično zanko, ki veže Hfq in od rho neodvisen terminator. Zraven teh elementov, pa so poliU rep, ki je del terminatorja, podaljšali tako, da je bil sposoben vezati RNA šaperon Hfq [1, 6]. Prav tako so na 5'-konec ''dolge strukture'' pripeli reverzni komplement START-kodona ATG in 21 nt dolg zapis za zeleni fluorescirajoči protein (GFP) ter to izrazili v ''E.coli'' BL21(DE3). Ugotovili so, da taka dolga struktura uspe v 70,6 %-ih utišati izražanje GFP-ja zapisanega na plazmidu pCOLADuet-gfp. Ta plazmid so skonstruirali tako, da so vstavili Shine-Dalgarnovo zaporedje in ''gfp'' kodirajočo regijo med restrikcijski mesti za restriktazi BgIII in XhoI [1].
Naslednja stopnja je bila delecija nesparjene z AU bogate škatle. Tako strukturo so poimenovali ''srednja struktura'' in je pri utišanju bila uspešna v 74,3 %. Potem so delo nadaljevali tako, da so uničili lasnično zanko, ki je vezala Hfq in nekoliko spremenili z AU bogato škatlo tako, da je bila ta sposobna tvoriti interakcije v večji meri kot sicer. Tako so ustvarili ''kratko strukturo'', ki je bila sposobna utišanja v približno enaki meri kot ''srednja struktura''. Te modifikacije struktur so demonstrirale, da so lahko tudi precej enostavnejše sekundarne strukture, kot jih tvorijo naravne sRNA ali že predhodno ustvarjene sRNA, enako učinkovite pri utišanju izražanja genov. [1].
Prav tako so preverjali ključnost nesparjene z AU bogate škatle. Mutanti, pri katerih so zamenjali štiri nukleotide in pri mutantnih, katerih zapis je bil skrajšana oblika osnovnega (divjega tipa), so še vedno opazili visoko sposobnost utišanja gena ''gfp'', in sicer med 71,2 in 87,0 %. Tako so dokazali, da prisotnost nesparjene z AU bogate škatle ni nujna. Za razliko od nenujne prisotnosti z AU bogate škatle, pa so dokazali, da je prisotnost proteina Hfg nujna – v mutantih, ki le-tega niso vsebovali, je bila uspešnost utišanja genov le v približno 40 %-ih [1]. 


== Razrešitev osnovne strukture ssl-sRNA ==


Primerjali so sposobnost utišanja ssl-sRNA (angl. single stem loop small non-coding RNA) tako, da so preverjali delež izražanja ob uporabi različnih terminatorjev (ne od rho neodvisnega terminatorja). Eden izmed teh je bil GadY, drugi je bil CT – klasični ohranjeni prokariontski intrinzični terminator, tretji pa je bil bakteriofagni T7 terminator. S primerjavo ravni izražanja teh treh terminatorjev so prišli do zaključkov, da precej robustni terminatorji, kot je npr. T7 terminator, za aktivnost sRNA niso dobri, kar pa pripisujejo učinkom steričnih ovir, ki jih ustvarijo in različnim konformacijam oziroma strukturam, ki nastanejo [1].


== Avtomatizirani dizajn ssl-sRNA s programiranjem regulatornih regij ==

Želeli so preveriti kako različno nukleotidno zaporedje regije, ki se zvije v sekundarno strukturo, vpliva na aktivnost ssl-sRNA. Najprej so preverili kako sta povezana minimalna prosta energija osnovne strukture in aktivnosti ssl-sRNA s programom RNAfold, ki je del računalniškega programa ViennaRNA Package 2.0 [1, 7]. RNAfold je program, ki preračuna minimalno prosto energijo in uporabniku ponudi najustreznejšo sekundarno strukturo na podlagi tega izračuna [7]. Z rezultati niso bili ravno zadovoljni, saj je bil koeficient korelacije precej slab (R2 = 0.64) [1].

Naslednja naloga, ki so si jo zadali, pa je bila analiza termodinamike osnovne strukture. Te parametre so določili s programom RNAeval, ki je prav tako del računalniškega programa ViennaRNA Package 2.0 [1, 7]. RNAeval je program, ki izračuna energijo dane strukture, ki jo tvori neko zaporedje, sposoben pa je tudi ponovno preračunati energijo nekega zaporedja s predlagano strukturo z različnimi energijskimi modeli [7]. Po tem, ko so ugotovili, da dolžina poliU repa ne spremeni termodinamskih parametrov osnovne strukture, so strukturo zanke pretvorili v šest manjših zank in lasnično zanko ter analizirali termodinamiko posamezne zanke. Našli niso nobene zanesljive korelacije med termodinamskimi parametri posameznih zank in lasnične zanke z aktivnostjo ssl-sRNA in tako zaključili, da zanke ne prispevajo niti neodvisno med seboj niti vsaka posamezna na enak način in zato treba njihovo termodinamiko vzeti v obzir, kadar govorimo o regulatorni aktivnosti sRNA. Predlagali so tudi nekaj dodatnih modelov, s katerimi so izboljšali delež utišanja z ssl-sRNA in s tem zmanjšali nivoje izražanja GFP-ja [1] .


== sslRNAD ==


Z uporabo matematične formule so razvili platformo, ki omogoča dizajn več kot 100.000-ih ssl-sRNA za kateri koli tarčni gen. Na tem vmesniku uporabniki vnesejo tarčno zaporedje z dolžino 20 – 30 nt in določijo željeno jakost vezave (in s tem regulacijsko aktivnost) – močno, srednjo ali šibko. Program nato ponudi zaporedja za randomizirane zankaste strukture in generira kandidate ssl-sRNA. Le-ti so nadaljnje filtrirani preko strukturne analize s programom Nucleic Acids Package NUPACK v4.0.0.23 [1]. NUPACK je razvijajoč se računalniški program za analizo in dizajn sistemov nukleinskih kislin. Omogoča analize (termodinamske analize razredčenih raztopin nukleinskih kislin, ki med seboj interagirajo), dizajn (dizajn zaporedja za komplekse nukleinskih kislin z namenom, da bi te zavzele določene sekundarne strukture) in uporabo različnih pripomočkov (ovrednotenje, prikaz in anotacija kompleksov nukleinskih kislin). Torej so bili algoritmi NUPACK razviti predvsem v kontekstu sekundarnih struktur nukleinskih kislin [8]. Po filtriranju  predlaganih sekundarnih struktur s programom NUPACK pa se delo v sslRNAD nadaljuje tako, da se strukture ovrednotijo na podlagi termodinamskih parametrov in potem se vsi ti rezultati prikažejo uporabniku. Ta postopek uporabnik ponavlja, dokler nima prikazanih dovolj predlogov ssl-sRNA [1].


== Zaključek ==


sRNA se kot pomemben regulator izražanja genov strukturno delijo na tri funkcionalne elemente: regijo, ki tvori bazne pare z mRNA, strukturo, ki veže protein Hfq in od rho neodvisen terminator. V raziskavah, narejenih v okviru članka, so pripravili tri različno dolge konstrukte in preverjali njihovo sposobnost utišanja izražanja genov. Prav tako so preverili nujnost prisotnosti drugih funkcionalnih elementov in različne modifikacije le-teh. Kot pomemben korak na področju razvoja sintetičnih molekul sRNA pa so razvili računalniški program sslRNAD, ki  omogoča dizajn različnih sRNA za željeni tarčni gen. 


== Viri ==


[1]	Y. Wang et al., “Gene knockdown by structure defined single-stem loop small non-coding RNAs with programmable regulatory activities,” Synth Syst Biotechnol, vol. 8, no. 1, pp. 86–96, Mar. 2023, doi: 10.1016/J.SYNBIO.2022.11.006.
[2]	T. Dutta and S. Srivastava, “Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms,” Gene, vol. 656, pp. 60–72, May 2018, doi: 10.1016/J.GENE.2018.02.068.
[3]	T. J. Soper, K. Doxzen, and S. A. Woodson, “Major role for mRNA binding and restructuring in sRNA recruitment by Hfq,” RNA, vol. 17, no. 8, p. 1544, Aug. 2011, doi: 10.1261/RNA.2767211.
[4]	K. S. Wilsont and P. H. Von Hippel, “Transcription termination at intrinsic terminators: The role of the RNA hairpin (Escherichia coli/RNA polymerase/rho-independent termination),” vol. 92, pp. 8793–8797, 1995, Accessed: May 06, 2023. [Online]. Available: https://www.pnas.org
[5]	M. Noh, S. M. Yoo, D. Yang, and S. Y. Lee, “Broad-Spectrum Gene Repression Using Scaffold Engineering of Synthetic sRNAs,” ACS Synth Biol, vol. 8, no. 6, pp. 1452–1461, Jun. 2019, doi: 10.1021/acssynbio.9b00165.
[6]	H. Otaka, H. Ishikawa, T. Morita, and H. Aiba, “PolyU tail of rho-independent terminator of bacterial small RNAs is essential for Hfq action,” Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 108, no. 32, pp. 13059–13064, Aug. 2011, doi: 10.1073/PNAS.1107050108.
[7]	R. Lorenz et al., “ViennaRNA Package 2.0,” Algorithms for Molecular Biology, vol. 6, no. 1, pp. 1–14, Nov. 2011, doi: 10.1186/1748-7188-6-26/TABLES/2.
[8]	J. N. Zadeh et al., “NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems,” J Comput Chem, vol. 32, no. 1, pp. 170–173, Jan. 2011, doi: 10.1002/JCC.21596.