View source for Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vplivan na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].


==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tri dimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].
Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo s ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].
Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 M človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].
3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 M in 1 M človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].
Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 M trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].
 

==Literatura==

[1]	Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2]	Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.