View source for Povezovanje celične komunikacije z optogenetiko: implementacija svetlobno inducibilnega medceličnega sistema v kvasovkah

''Povzeto po članku: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.2c00338?ref=pdf V. Rojas, L. F. Larrondo: Coupling Cell Communication and Optogenetics: Implementation of a Light-Inducible Intercellular System in Yeast. ACS Synth. Biol. 2023, 12, 71–82 ]''

==Uvod==
Komunikacija omogoča učinkovit prenos informacije med živimi organizmi. Delimo jo na dva tipa: prvi temelji na neposrednem medceličnem stiku, drugi pa na izločanju signalnih molekul. Medcelična komunikacija, ki temelji na signalnih molekulah je zelo pogosta pri ustvarjanju umetnih sistemov v mikroorganizmih. Cilj takih sistemov je preučevati vpliv zunanjih dejavnikov na uravnavanje bioloških procesov. Njihova ključna komponenta je genski konstrukt, ki omogoči inducibilno nastajanje signalnih molekul. Večina današnjih umetnih medceličnih sistemov se odziva na kemične induktorje. Slaba stran kemičnih induktorjev pa je njihova toksičnost, ireverzibilnost in nizka prostorsko-časovna ločljivost. Kot alternativa se je v zadnjih letih izkazala optogenetika. Ta tehnologija temelji na uporabi naravnih ali umetnih fotoreceptorjev, ki so občutljivi na svetlobo točno določene valovne dolžine [1].

===Zakaj so kvasovke ''Saccharomyces cerevisiae'' primerne za implementacijo optogenetskega sistema?===
''Saccharomyces cerevisiae'' je enocelična kvasovka z dobro raziskanim genomom, kar olajša oblikovanje umetnih genskih konstruktov. Ker v genomu nimajo zapisa za delujoč fotoreceptor, so primerne za poskuse z implementacijo optogenetskega sistema. Druga prednost uporabe kvasovk pa je njihova medcelična komunikacija s feromoni. Feromoni so majhne difuzne signalne molekule, ki se vežejo na svoje z GPCR sklopljene receptorje. Sprožijo proces spolnega razmnoževanja, ki vključuje aktivacijo kaskadne poti MAPK. Ta vodi v kemotropično rast celic, kar zelo vpliva na nivo izražanja genov, celično delitev in morfologijo celic. Zaradi feromonov se lahko nepremične celice kvasovk zbližajo in se združijo v diploidno zigoto [1].

Izražanje gena za omenjen feromon v kvasovkah je že bilo uspešno izvedeno z različnimi eksogenimi kemičnimi induktorji, kot so galaktoza, estradiol, NaCl, progesteron, estradiol in deksametazon ter rastlinskimi signalnimi molekulami avksini. Novi, bolj kompleksni tipi sistemov, pa delujejo tako, da imajo komponente za izvajanje specifičnih bioloških procesov porazdeljene v dveh ali več neizogenih celičnih populacijah. Na tak način se med seboj povezujejo različni sevi, zmanjšata se presnovna obremenitev celice in stohastičen šum ter poveča genomska stabilnost [1].

==Opis sevov kvasovk in optogenetskega stikala==
===Opis sevov kvasovk za medcelično komunikacijo z uporabo optogenetike===
Optogenetski sistem tvorita dva različna tipa celic oz. seva kvasovk: oddajniški in prejemniški sev. 

Oddajniški sev (OS) je bil narejen na osnovi genoma seva MATa, ki je imel pod promotorjem PGAL1 vgrajen kodirajoče zaporedje za feromon α-faktor (MFα1). Sev OS je bil transformiran še z vektorjema, ki sta nosila rekombinantne zapise za transkripcijski faktor GAL4. En plazmidni vektor je nosil zapis za DNA-vezavno domeno transkripcijskega faktorja GAL4 in je bil povezan z zapisom fotoreceptorja WC-1. Drugi plazmid pa je nosil zapis za transaktivirajočo domeno transkripcijskega faktorja GAL4 in je bil povezan z zapisom domene LOV od fotoreceptorja VVD (VIVID) [1],[2]. 
 
Prejemniški sev (R) je bil narejen na osnovi genoma seva BY4741, ki je pod promotorjem PFUS1 nosil zapis za luciferazo, ki je služila kot reporterski gen. Delovanje omenjenega promotorja je bilo odvisno od  α-faktorja [1]. 

===Opis optogenetskega stikala in komunikacije med celicami===

Optogenetsko stikalo FUN-LOV omogoča od modre svetlobe odvisno interakcijo med fotoreceptorjema WC-1 in VVD. Oba fotoreceptorja sta občutljiva na modro svetlobo, izhajata iz  nitaste glive ''Neurospora crassa'' in interagirata preko domene LOV. Stikalo deluje tako, da osvetljevanje oddajniškega seva (OS) povzroči interakcijo med domenama LOV, ki tako povežeta dve polovici transkripcijskega faktorja GAL4. Ko je tako povezan transkripcijski faktor GAL4 vezan na promotorsko regijo PGAL, sproži prepis gena za α-faktor. Feromon se iz celice izloči in prepozna vezavno mesto membranskega receptorja Ste2 na prejemniški celici, ki se nahaja v okolici. To v prejemniškem sevu povzroči aktivacijo reporterskega gena, luciferaze, ki je pod feromon-odvisnim promotorjem PFUS1 [1],[2].

===Dodatne spremembe genoma celic===
Oddajniški sevi (OS) in prejemniški sevi (R) so bili še dodatno spremenjeni. Sev označen s številom 2 je imel izbrisan gen za proteazo Bar1, ker se je pri izhodiščnem sevu (označen s številom 1) izkazala za problematično. Namreč vloga proteaze je, da oblikuje gradient različnih feromonov in je α-faktor cepila na dva neaktivna dela. Sev označen s številom 3 pa je imel izbrisan gen za omenjeno proteazo in tudi za protein Far1, ki je bil pomemben pri regulaciji celične delitve kvasovk [1].

==Rezultati==

===Prejemniški sev R3 se najbolje odziva na dodajanje eksogenega α-faktorja===
Eksogeno raztopino α-faktorja so v različnih koncentracijah dodali prejemniškim sevom (R). Ugotovili so, da je sev R1 dal signifikanten signal še le pri 5 μM, medtem ko sta seva R2 in R3 dala močan signal že pri 1 μM. Vzrok najverjetneje tiči v deleciji gena za proteazo Bar1. Optična gostota celic sevov R1 in R2 je bila z dodajanjem feromona vedno manjša od kontrolnega poskusa, medtem ko je bila optična gostota celic seva R3 enaka kontrolnemu poskusu. Vzrok najverejtne tiči v dleciji gena za protein Far1, ki uravnava celični cikel kvasovk. V vseh treh sevih pa je bilo opaženo, da se pri višjih koncentracijah feromona odziv ni bistveno povečeval [1].

===Izločanje proteaze Bar1 zmanjša učinek feromona===
Izločanje α-faktorja so merili tako, da so supernatant oddajniških sevov (OS), ki so jih 24-ur izpostavljali beli svetlobi, dodali gojišču s sevi prejemniških celic in opazovali luminiscenco. Ugotovili so, da v supernatantu seva OS1 ni bilo dovolj feromona, ki bi izzval signal pri vseh treh različnih sevih R. Močan signal pa je bil zaznan v hipersenzitivnih prejemniških sevih (R2 in R3), ko so jim dodali supernatant sevov OS2 in OS3. Supernatnata sevov OS2 in OS3 nista izzvala signifikantnega signala v sevu R1, kar nakazuje na pomen proteaze Bar1. V kontrolnem poskusu, pri katerem so seve OS 24 ur hranili v temi, nikoli ni prišlo do luminiscence [1]. 

===Svetloba omogoča komunikacijo med neizogenimi sevi kvasov===
Poskusi s kokulturami oddajniških (OS) in prejemniških sevov (R) v različnih razmerjih so potekali 24 ur. Le določene kokulture v razmerju 1:1 so v prvih 10 urah izpostavljenosti konstantni modri svetlobi dale merljiv signal. Komaj zaznavno luminiscenco so opazili v kokulturah z OS1 in tudi, kadar so vsebovale sev R1. Kokulture s sevom R2 so prej dosegle maksimalno vrednost luminiscence kot kokulture s sevom R3. Vzrok zamika je verjetno v odsotnosti proteina Far1 [1]. 

===Kratka izpostavitev kokultur temi in večji delež sevov R povečata izražanje reporterskega gena===

Izvajali so tudi 24-urne poskuse s kokulturami, ki so jih najprej imeli nekaj ur v temi, nato pa jih osvetljevali z modro svetlobo. Pri razmerju sevov 1:1 (OS:R) so dobili v primeru 1-,2- in 6-urne izpostavljenosti temi večji signal kot pri 8-, 10- in 12-urni izpostavljenosti temi. Domnevajo, da je za to kriva narava promotorja FUS1. Izvajali so tudi poskuse različnih deležev sevov OS in R. Odziv se je povečal, kadar je bil delež volumna seva R trikraten deležu seva OS in pomanjšal v obratnem razmerju [1]. 

===Avtonomna različica seva kvasovke===
Ustvarili so tudi avtonomno različico (A) seva kvasovke, ki je vsebovala zapis za stikalo, feromon in reporterski gen. Ti sevi so pokazali nekoliko večji odziv v poskusu 24-urne osvetlitve z modro svetlobo in tudi v poskusu vklopa svetila po 4 urah. Za razliko od prejšnjih poskusov s kokulturami je bila tokrat v poskusih, ki so se izvajali v popolni temi, prisotna šibka luminiscenca [1]. 

==Zaključek==

Celična komunikacija omogoča prenos informacije o stanju celice v njeno okolico. Da bi razumeli povezanost celične komunikacije s celično delitvijo, diferenciacijo in preživetjem celice, je bilo ustvarjenih več različnih umetnih sistemov, na katere vplivajo kemični induktorji.
V tej študiji pa so se namesto kemičnega induktorja posluževali optogenetike, ki so jo izvajali na brstečih kvasovkah ''Saharomices cerevisiae''. Njihov pristop je bil osnovan na dveh sevih kvasovk, ki sta se med seboj sporazumevali preko svetlobno odvisne sinteze feromona α-faktorja, tako da je le ta v drugem sevu sprožil izražanje reporterskega gena. Rezultati so pokazali, da lahko zunanja informacija, kot je svetloba, vpliva na gensko izražaje v umetnih mikroorganizmih.

==Literatura==

[1]	V. Rojas, L. F. Larrondo: Coupling Cell Communication and Optogenetics: Implementation of a Light-Inducible Intercellular System in Yeast. ACS Synth. Biol. 2023, 12, 71–82.

[2]	F. Salinas, V. Rojas, V. Delgado, J. López, E. Agosin, L. F. Larrondo: Fungal light-oxygen-voltage domains for optogenetic control of gene expression and flocculation in yeast. MBio 2018, 9, 1–14.