View source for Raziskovanje temperaturno posredovane replikacije plazmida kot reverzibilnega in preklopljivega proteinskega ekspresijskega sistema v Escherichia coli

''Povzeto po članku'': [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1876107023000810 Y. C. Yi, S. I. Tan, R. E. Hu, C. C. Hsiang, J. Y. Lin, S. S. W. Effendi, I. S. Ng: Exploring temperature-mediated plasmid replication as a reversible and switchable protein expression system in genetic ''Escherichia coli''. J. Taiwan Inst. Chem. Eng. 2023, 144, 104751.]


== Uvod ==
Pri ekspesijskih celičnih sistemih si velikokrat pomagamo z inducibilnimi signali kateri lahko sprožijo začetek oz. konec neke reakcije v celicah. Pri tem si velikokrat pomagamo s kemični signali (npr. IPTG, pH, …), vendar pa zadnje čase postajajo zelo zanimivi fizični induktorji kot npr. temperatura, saj so poceni in ne invazivni. Znano je že, da lahko s toploto vplivamo na izražanje genov preko toplotno odvisnih represorjev kot npr. cI857 represor, ki vsebuje mutacijo katera povzroči denaturacijo represorja ob povišanju temperature s 30 na 42°C. Ni pa znano kako toplota vpliva na podvajanje različnih plazmidov v ''E.coli'' kar pa so se avtorji tega članka odločili raziskat [1,2].

== Učinek temperature na različne ori ==
Z namenom opazovanje toplotnega učinka na različne ori so avtorji članka pripravili plazmide, kateri so gen za sfGFP imeli vključen pod istim konstitutivnim promotorjem (pJ23100) in RBS, razlikovali pa so se v ori zaporedjih. Ori, ki so bili vključeni v raziskavo so bili RSF1010 (pJUMP45-2A), pSC101 (pSCA-JG), CloDF (pCDF-JG), pUC (pSU-JG) in RSF (pRSF-JG) ([https://drive.google.com/file/d/1gGTgxA-Qm3Iv9UlpNgCj_6jHGlC_8X7w/view?usp=sharing slika 1]). Pri tem so opazovali kako izpostavljanje, s temi plazmidi transformiranih celic (''E.coli'') temperaturam 30, 37 in 42 °C vpliva na izražanje proteina sfGFP in število podvojenih plazmidov v celici (PCN – ''plasmid copy number'') [1].

Glede na to kako je sprememba temperature vplivala na izražanje sfGFP in PCN, so te plazmide oz. ori zaporedja razdelili v tri skupine (slika 2). V prvo skupino so dali ori RSF1010, saj temperatura ni imela večjega vpliva na PCN ter izražanje sfGFP. V drugo skupino so umestili ori zaporedja pSC101 in CloDF13, saj se je izkazalo, da se je izražanje proteina sfGFP z naraščanjem temperature zmanjševalo kar pa je verjeto posledica zmanjšanja števila plazmida v celici. V tretjo skupino pa so umestili pUC in RSF kjer se je pa pokazalo, da je z naraščanjem temperature izražanje proteina sfGFP in PCN začelo naraščati. Intenzivnost fluorescence se je pri pSU-JG izboljšala za 7-krat po zvišanju temperature kulture s 30 na 42 °C, medtem ko se je PCN izboljšal za 2,44-krat. Zanimivo je, da je plazmid s RSF ori pokazal najnižjo intenzivnost fluorescence pri vseh temperaturah, kljub temu, da je imel ta najvišji PCN. Nizka stopnja izražanja v pRSF-JG je najverjetneje bila posledica presnovne obremenitve, ki jo je sprožilo povpraševanje po nukleotidih za replikacijo plazmidne DNA. Tako so iz teh rezultatov lahko potrdili, da s temperaturo lahko vplivamo na sposobnosti podvajanja različnih ori, s čimer lahko dosežemo različno ekspresijo proteinov [1].

== Število kopij plazmida in izražanje sfGFP z različnimi promotorji in toplotno odvisnimi ori ==
Enkrat ko so ugotovili kateri ori se odzivajo na spremembe v temperaturi so želeli preveriti kako različni promotorji vplivajo na PCN in ekspresijo sfGFP proteina pri različnih temperaturah in ori zaporedjih in vivo. Pripravili so plazmide z različnimi ori in promotorji pod  katerimi je bil vstavljen zapis za sfGFP. V tej raziskavi so preverjali promotorje  J23100, J23109 in T7. Promotorja J23100 (močan), J23109 (šibek) sta oba konstitutivna in spadata pod družino Andersonovih promotorjev [1,3].
 
Zanimivo je, da so se signali sfGFP povečali skupaj s povišano temperaturo pri 3 sevih (J23109 s pUC ori, J23100 s pUC ori in T7 z RSF ori). Za J23109 se je intenziteta fluorescence sfGFP povečala s 406 a.u. do 750 a.u. in 1504 a.u. ko se je temperatura dvignila s 30 na 37 in 42 °C, kar kaže na 1,8- oziroma 3,7-kratno povečanje. Za promotor J23100 se je razmerje intenzivnosti fluorescence sfGFP med 30 in 42 °C povečalo za 3,1-krat (s 6800 a.u. na 20.900 a.u.). Rezultat je pokazal, da so promotorji J23100, J23109 pokazali povečan signal sfGFP in PCN pUC ori ob povišanju temperature. Poleg tega pa je RSF ori s promotorjem T7 prav tako pokazal podoben trend kot promotor J23100, prikazan na sliki 2. Intenzivnost fluorescence pod promotorjem T7 je bila povečana s 20.080 a.u. pri 37 °C do 35.200 a.u. pri 42 °C pri čemer pa se je PCN tudi povečal (tabela 1). Rezultati so potrdili, da se lahko replikacija pUC in RSF ori poveča pri višji temperaturi ne glede na promotor [1].

== Uporaba promotorja T7 v sistemu dvojnih plazmidov s toplotno odvisnim ori ==
Z namenom priprave toplotno nadzorovanega in reverzibilnega sistema za izražanje proteinov so avtoji želeli preverit kako lahko od toplote odvisne ori uporabijo v sistemu dvojnih plazmidov (''ang. dual plasmids system''). Predvsem jih je zanimal fenomen »vklop/izklop« v bakterijah ''E.coli'' seva BL21 (DE3). Za to raziskavo so pripravili dve vrsti plazmida pri čemer je bil sfGFP vstavljen v plazmid pHCC, ki vsebuje "temperaturno inducibilen" RSF ori, medtem ko je bil RFP vstavljen v plazmid pSB4A3, ki vsebuje "temperaturno represibilen" SC101 ori. V obeh plazmidih so kot promotor uporabili promotor T7 ter take plazmide transformirali v ''E.coli seva'' BL21(DE3) (sev HGLR). Zanimalo jih je kako se bo razmerje med proteinoma sfGFP in RFP spremenilo, če transformirane bakterije izpostavijo temperaturam 22, 30 in 37°C. Pri tem poskusu so izbrali nižje temperature, ker sistem T7 pri nižjih temperaturah bolje izraža proteine. Kot je prikazano na sliki 3, se je intenzivnost sfGFP povečala za 6-krat, intenzivnost RFP pa se je zmanjšala na 10% začetne vrednosti, ko se je temperatura povečala s 22 na 37 °C. Poleg tega je PCN pokazal podoben trend, da se je RSF ori povečal in pSC101 ori zmanjšal pri 37 °C [1].
 
Zanimivo je, da povečanje PCN RSF ori v sistemu z dvojnim plazmidom ni bilo tako očitno kot tisto v sistemu z enim plazmidom (slika 2B), napram zmanjšanju PCN pSC101 ori v sistemu z dvojnim plazmidom. Do tega je lahko prišlo zaradi presnovne obremenitve, katera pa je posledica uporabe sistema dvojnih plazmidov, kar lahko povzroči različne rezultate pri uporabi pSC101 in pUC ori. Na splošno predstavljajo spremembe PCN, ki ustrezajo različnim ori pri različnih temperaturah v eni celici nov nadzor za proizvodnjo več proteina [1].

== Razvoj toplotno posredovanega sistema za proizvodnjo itakonske kisline ==
S tako pripravljenim T7 sistemom katerega so lahko reverzibilno »vključili/izključili« so želeli preveriti kako dobro deluje v dvostopenjskem procesu sinteze itakonske kisline (IA). IA se da sintetizirat v dveh korakih pri čemer začnemo iz citrata katerega s akonitazo (EcAcnA) pretvorimo v cis-akonitat, tega pa s dekarboksilazo (AtCasA) pretvorimo v IA. Reakcija je zaporedna kar pomeni, da bodo različne koncentracije teh dveh encimov povzročile različne količine produktov iz česar lahko nato sklepamo kako smo na reakcijo vplivali [1,4]. 

Za ta namen so pripravili dva seva bakterij ''E.coli'' BL21(DE3) (imenovana HELA in HALA) pri čemer so vsakemu vstavili dva različna plazmida (sistem dvojnih plazmidov). En sev HELA je imel zapisan gen za EcAcnA na plazmidu pHCC s RSF ori in gen za AtCadA na plazmidu pSB4A3 s pSC101 ori. Drugi sev HALA pa je imel zapisan gen za AtCadA na plazmidu pHCC s RSF ori in gen za EcAcnA na plazmidu pSB4A3 s pSC101 ori. Analiza SDS-PAGE je pokazala, da se je količina EcAcnA povečala in AtCadA zmanjšala, ko se je temperatura povečala z 22 na 37 °C v sevu HELA ( vsebuje pHCC-EcAcnA in pSB4A3-AtCadA) (slika 4B, levo). Nasprotno pa se je pri sevu HALE (vsebuje pHCC-AtCadA in pSB4A3-EcAcnA) izražanje EcAcnA postopoma zmanjšalo, medtem ko se je  koncentracija AtCadA povečal ob spremembi temperature z 22 na 30 in 37 °C (slika 4B, desno). Podrobna analiza PCN in IA pri 3 različnih temperaturah (22, 30 in 37 °C) je prikazana v tabeli 2. PCN dvojnih plazmidov za proteina EcAcnA in AtCadA je bil skladen s sfGFP in RFP (prej opisan poskus) kar kaže, da bi bil lahko RSF ori inducibilen s toploto, medtem ko je pSC101 ori povezan s hladno inducibilnostjo (torej aktiven pri nižjih temperaturah). Zanimivo pa je, da so bile vrednosti PCN za pHCC-EcAcnA  (21,3 pri 22 °C, 230,6 pri 30 °C in 321,9 pri 37 °C) višje kot pri pHCC-AtCadA (tj. 12,1 pri 22 °C, 80,9 pri 30 °C in 107,1 pri 37 °C). Prejšnje študije so pokazale, da je reakcija, ki jo katalizira AtCadA, stopnja, ki določa hitrost pri proizvodnji IA. To razloži zakaj je bila proizvodnja IA boljša pri uporabi seva HALE, kjer je bila izraženost AtCadA višja (AtCadA na plazmidu pHCC s RSF ori) [1].

== Zaključek ==
Prejšnje študije so pokazale, da inducibilnost in regulacija toplote temeljita izključno na temperaturno občutljivem represorskem genu cI857. V tem članku so avtorji odkrili, da na replikacijo določenih ori vpliva temperatura kar je mogoče uporabiti v sintetični biologiji za programiranje celice tako, da se te odzivajo na visoke ali nizke temperature s čimer se lahko nadzoruje tudi izražanje proteinov.

== Literatura ==
[1]	Y. C. Yi, S. I. Tan, R. E. Hu, C. C. Hsiang, J. Y. Lin, S. S. W. Effendi, I. S. Ng: Exploring temperature-mediated plasmid replication as a reversible and switchable protein expression system in genetic Escherichia coli. J. Taiwan Inst. Chem. Eng. 2023, 144, 104751.

[2]       Royah Vaezi, Kun Xue. Temperature Sensitive Lambda cl Repressor. [19. 5. 2023] http://parts.igem.org/Part:BBa_K200011

[3]       Johan Anderson. Constitutive promoter family member. [20. 5. 2023] http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100

[4]       Aconitic Acid. ScienceDirect. [20. 5. 2023] https://www.sciencedirect.com/topics/pharmacology-toxicology-and-pharmaceutical-science/aconitic-acid