View source for Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah

Izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/s41467-023-44379-5 Optogenetic spatial patterning of cooperation in yeast populations]


== Uvod ==
V mikrobioloških kolonijah je vedno prisotna kompeticija za hrano ter prostor. Pri določenih mikrobih in mikrobiomih pa so prisotni procesi ki omogočajo kooperacijo med celicami. Eden izmed teh primerov je prisoten pri glivi kvasovki (''S. cerevisiae'') kjer imajo celice prisoten encim SUC2p invertazo. Te celice imenujemo kooperatorji. Ta encim omogoča celicam razgradnjo saharoze na glukozo in fruktozo (heksoze) ki predstavljata vir hrane za celice v okolici. Hidroliza saharoze poteka v periplazemskem prostoru. Večina produktov se izloči iz celice nekaj pa jih porabi kooperator kot vir hrane. Nekatere glive kvasovke pa nimajo prisotnega gena za invertazo in tako ne morejo hidrolizirati saharoze. Te, tako imenovane, goljufive celice so v celoti odvisne od kooperatorskih celic za vir hrane. Raziskovalci so hoteli določiti velikosti domen kooperatorjev in goljufivih kvasovk kjer kooperacija poteka optimalno in tako omogoča optimalno rast kvasovk ter proizvodnjo encima [1-3].

== Metoda za detekcijo kooperacije ==
Za analizo kooperacije med kooperatorskimi in goljufivimi celicami so uporabili optogenetiko. Metoda temelji na uporabi svetlobe za aktivacijo celic. Ta tehnika se uporablja v nevrologiji za identifikacijo funkcije nevronov v možganih ter za zdravljenje možganskih motenj. V tem primeru so uporabili genetsko modificirane kvasovke ki so sintetizirale SUC2p encim ob prisotnosti modre svetlobe. Za primerjavo kooperacije/kompeticije celic so izvedli več poskusov kjer so spreminjali osvetljeno območje ter intenziteto svetlobe [1,4,5].

== Genske modifikacije ==
Goljufivim celicam so vstavili konstitutiven promotor ter zapis za svetlobno občutljiv transkripcijski faktor EL222 (∆SUC2 celice). Kooperativne celice pa so pred SUC2 gen pridobile pC120 promotor, ki je svetlobno inducibilen ter odvisen od EL222. Ta zapis so združili s zapisoma za P2A ter YFP (yPH_471 celice). YFP zapis je reporter da se SUC2p invertaza sintetizira, P2A sekvenca pa omogoča ločen nastanek invertaze ter fluorescenčnega reporterja (ni fuzije proteinov) [1]. 

Divji tip ter ∆SUC2 celice pod svetlobo niso imele dovolj visoke encimske aktivnosti za nadaljnjo delo, yPH_471celice pa so imele bolj intenziven odziv v obliki tvorbe invertaze kot divji tip. Kljub temu so bile potrebne modifikacije saj so ∆SUC2 celice imele slabšo rast od divjega tipa ter yPH_471 celice so imele boljšo rast od ∆SUC2 tudi ob odsotnosti svetlobe. Dolgotrajna obstojnost SUC2p proteina je verjetno povzročalo puščanje pC120 promotorja kar je vodilo v akumulacijo proteina v periplazemskem prostoru [1]. 

Z namenom zmanjšanja puščanja so genski zapis nadaljnjo modificirali tako da so zmanjšali število vezavnih domen na pC120 promotorju ter dodali lasnico za hitrejšo degradacijo mRNA SUC2 gena. V določene celice so vstavili obe spremembi (yPH_540) v druge pa samo zapis za lasnico (yPH_536) ter njihove kolonije obsevali s svetlobo. yPH_536 kvasovke so imele najboljše rezultate v razliki rasti med prisotnostjo in odsotnostjo svetlobe zato so v nadaljnjih poskusih uporabljali te celice [1]. 

== Optocube ==
Kolonije kvasovk so rasli na trdih agarjevih gojiščih saj je tako bilo lažje meriti tvorbo SUC2p invertaze ter analizirati kooperacijo kot v tekočih gojiščih. V tekočih gojiščih je zaradi celične rasti prišlo do izrivanja kooperatorjev iz osvetljenih območij. Poleg tega je bila sposobnost tvorbe encima v teh izrinjenih celicah še vedno prisotna kar je onemogočilo določitve meje med kooperatorji in goljufivimi celicami. Povsod so celice najprej stradali preden so jih prenesli na gojišče z 1% saharoze.  Specifično so celice kvasovke nanesli na gojišče ki je na površini imelo plast s 0,5% agaroze pod tem pa se je nahajal fitagel s saharozo [1]. 

Za pridobitev najboljših rezultatov so naredili tako imenovan OptoCube. To je temperaturno nadzorovana komora kjer so lahko natančno obsvetili agarske plošče s  poljubnimi intenzitetami ter vzorci svetlobe. Plošče so skenirali znotraj inkubatorja ter analizirali rast celic ter tvorbo invertaze. Na osvetljenih območij so se pojavile kolonije celic ki so bile zmožne hidrolize saharoze (kooperatorske celice), v zatemnjenih območij pa so se tvorile kolonije goljufivih celic ki niso tvorile SUC2p invertaze (vse kvasovke tipa yPH_536). Zaradi nesposobnosti tvorbe virov hrane so goljufive kvasovke bile odvisne od heksoz ki jih kooperatorji izločijo po hidrolizi saharoze. Največja rast v zatemnjenih območij je bila zato na meji z osvetljenimi območij saj je bilo tam prisotnih največ produktov hidrolize. Kot je bilo predvideno je bolj intenzivna svetloba omogočala hitrejšo rast kvasovk saj se je tvorilo več encima ter tako potekalo več hidrolize saharoze iz gojišča kar je tvorilo več heksoz. Tvorba encima tako tudi vpliva na rast kvasovk. Največja rast je bila prisotna med 10 in 40 urami vendar različno hitro glede na intenziteto svetlobe. Na ploščah ni bilo prisotnega drugega vira hrane [1]. 

Za boljšo interpretacijo rezultatov so uporabili Michaelis-Menten enačbe ter Monod enačbo za računanje stopnje encimske reakcije in rast na podlagi koncentracije metabolitov hidrolize [1].  

== Domene kooperacije in kompeticije ==
 V naslednjem koraku so obsvetili agarske plošče s homologno svetlobo različnih širin. Po določenem času se je na osvetljeni površini pojavil nehomogen biofilm. Na širših območji  je večino kooperatorjev zraslo na obrobnih območij osvetljenega območja najverjetneje ker je bilo tam največ saharoze iz zatemnjenih območij. Širše ko je bilo osvetljeno območje manjša je bila gostota kooperatorjev na sredini tega območja. Ponovno lahko ta pojav razložimo s difuzijo saharoze saj ta rabi dlje časa da potuje do sredino osvetljenega območja kjer jo kooperatorji lahko porabijo. Kooperatorske celice tekmujejo za saharozo. Zato, ko je tam vsa saharoza porabljena kvasovke proizvedejo manj encima in je prisotna manjša količina heksoz. Gostota goljufivih celic pa se je povečevala. Goljufive kvasovke pa niso sposobne proizvesti encima ker niso osvetljene zato saharoza difundira v osvetljeno območje. Tudi gostota goljufivih celic je največja  na obrobnih območij saj je tam največje koncentracija heksoz ki za te kvasovke predstavljajo vir hrane. Tu je prisotna kompeticija goljufivih celic [1].

V zadnjem koraku pa so želeli vedeti meje osvetljenih domen na petrijevkah kjer še ne bi prišlo do kompeticije med kooperatorji in kompeticije med goljufivimi kvasovkami. Gojišča so obsevali s svetlobo določene širine ter merili gostoto celic. Ugotovili so da je gostota kooperatorjev ter goljufivih kvasovk odvisna od širine osvetljenih ter zatemnjenih območij. Določili so da je na osvetljenih območij širine 5 mm ali manj prišlo do kompeticije goljufivih celic saj je bilo premajhno število kooperatorjev ki so lahko proizvajali vir hrane (heksoze). Zato so bile celice v kompeticiji za hrano in je najvišja gostota celic bila ob mejnih območij osvetljenega območja. Pri zelo ozko osvetljenih območij pa ni bilo mogoče razlikovati med kooperatorskimi in goljufivimi kvasovkami (meja ni bila vidna) [1]. 

Na drugi strani pa so ugotovili da je na osvetljenih območij širine 20 mm ali več prišlo do kompeticije med kooperatorskimi celicami. Ponovno je po določenem času zmanjkalo saharoze v gojišču in v osrednjem območju svetlobne domene saharoza z difuzijo ni prišla saj so jo prej hidrolizirali drugi kooperatorji. Tako tudi ni bilo prisotnih veliko heksoz. To je zato omejevalo rast kvasovk v sredini osvetljene domene. Največja gostota kooperatorskih kvasovk je ponovno bila na mejnih območij [1]. 

Na podlagi tega so ugotovili da je rast kooperatorjev in goljufivih celic najboljša ko je območje kooperatorjev široko med 5 in 20 mm (osvetljeno območje). Drugače pride do kompeticije. Tu lahko naredimo analogijo s pasovno prepustnim filtorm kjer samo ponavljajoča se osvetljena območja določene širine med katerimi je določena razdalja (določene »frekvence osvetlitve«) lahko omogočajo primerne pogoje za rast kooperatorskih in goljufivih celic [1]. 

== Zaključek ==
Z uporabo optogenetike so lahko z uporabo SUC2p invertaze določili pogoje pri katerih pride do kooperacije ter kdaj do kompeticije med glivam kvasovkam. Gensko modificirane kvasovke so nanesli  na agarske plošče v OptoCube kjer jim je bilo omogočeno optimalno izražanje encima (tvorba biofilma). S pomočjo svetlobe jim je tako bilo omogočeno razumevanje spremembe metabolizma encima v kvasovkah ter kako količina tega vpliva na rast celic. Ta metoda in način poskusa bi lahko bilo nadaljnjo uporabno za analizo kooperatorskih ter kompeticijskih mehanizmov v drugih mikroorganizmih ter mikrobiomih. Prav tako to predstavlja način optimizacije pogojev gojenja za različne laboratorijske mikroorganizme in encimov ter raziskav človeških bolezni na koži ter posledičnih bolezni zaradi nenormalnosti človeškega mikrobioma [1]. 
== Literatura ==