View source for Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov Pseudomonas aeruginosa

Izhodiščni članek: [https://journals.asm.org/doi/10.1128/spectrum.02897-23# A synthetic biology approach to assemble and reboot clinically relevant Pseudomonas aeruginosa tailed phages] 


== Uvod ==
Zaradi problema odpornosti na antibiotike se njihovi uporabi kot alternativa za zdravljenje bakterijskih okužb ponuja uporaba bakteriofagov. Eden izmed glavnih izzivov pri razširjeni uporabi fagne terapije je ozko gostiteljsko območje posameznih fagov, ki pogosto niso sposobni okužiti večjega števila sevov. Z uporabo sinteznobioloških pristopov, kot je urejanje fagnega genoma, lahko spremenimo aminokislinsko zaporedje proteinov, ki jih fagi uporabljajo za pritrditev na gostiteljsko celico. Prav tako lahko v fagni genom dodamo elemente, ki se borijo proti gostiteljevim sistemom za obrambo pred genomskimi paraziti. Inženiring fagnih genomov nam tako omogoča razširitev gostiteljskega območja, kar pomeni, da je za zdravljenje različnih okužb potrebno manjše število različnih fagov [1].
  
Za pridobivanje fagov s spremenjenimi lastnostmi sta potrebna dva koraka; sestavljanje genoma in proizvodnja fagnih delcev. Ta dva koraka lahko potekata sočasno v enem sistemu ali pa ločeno. Načinov za sestavljanje spremenjenih fagnih genomov je več, pogosto se uporablja sestavljanje dvoverižnih fragmentov DNA s homologno rekombinacijo v ''Saccharomyces cerevisiae''. Ker v kvasovkah v večji meri ne pride do izražanja fagnih proteinov, v njih sestavljeni genomi nimajo velikega vpliva na rast kvasovk, kar je možen problem pri uporabi bakterij ''Escherichia coli''. Po sestavljanju fagnega genoma je potrebno proizvesti še fagne delce [1]. Ta proces imenujemo ponovni zagon (''angl.'' reboot), in se lahko izvede in vitro ali pa v bakterijskih celicah [1,2]. 

''Pseudomonas aeruginosa'' je patogena po Gramu negativna bakterija, ki se pogosto pojavlja pri bolnikih s cistično fibrozo. Trenutno se za zdravljenje uporabljajo antibiotiki. Razvita je bila tudi fagna terapija proti ''P. aeruginosa'', z uporabo fagov divjega tipa, vendar ti fagi nimajo idealnih lastnosti za uporabo v klinične namene. V raziskavi, predstavljeni v tem seminarju, so Ipoutcha in sodelavci sestavili in  ponovno zagnali genome fagov, ki so sposobni okužiti klinično pomembne seve ''P. aeruginosa''. Uspešno sestavljanje in ponovni zagon fagnih genomov predstavlja prvi korak, ki je potreben za proizvodnjo fagov za uporabo v fagni terapiji [1].

== Sestavljanje genoma bakteriofaga JG024  ==
Za uspešno kloniranje genomov v kvasovkah je te potrebno kotransformirati z lineariziranim vektorskim ogrodjem in genomom v enem ali več fragmentih. Posamezni fragmenti DNA morajo na koncih nositi primerno dolga zaporedja, ki so homologna zaporedjem na koncu naslednjega fragmenta v končnem konstruktu. Vektorsko ogrodje mora vsebovati mesto začetka replikacije in zapis za selekcijski marker za kvasovke.  Za sestavljanje genoma faga JG024 (rod ''Caudovirales''), ki lahko okuži ''P. aeruginosa'', so raziskovalci najprej določili zaporedje celotnega genoma. Genom je dolg približno 66 kb in je cirkularno permutiran. Podrobno poznavanje lastnosti genoma je predpogoj za ponovni zagon [1].

Za sestavljanje genomov so raziskovalci uporabili sev ''S. cerevisiae'' VL6-48N, ki se pogosto uporablja pri projektih sestavljanja oz. kloniranja genomov. Ta sev so Gibson in sodelavci uporabili za sestavljanje sintetičnega genoma ''Mycoplasma genitalium'' [3], in je bil razvit za sestavljanje DNA s homologno rekominacijo z visoko učinkovitostjo [4]. Ker je genom JG024 cirkularno permutiran, ima genom pakiran v različnih fagnih delcih različne konce. Zato so raziskovalci izolirano fagno DNA rezali s Cas9, kar jim je omogočilo, da so genom razdelili na levo in desno ročico. Če sta obe ročici vsebovali zaporedje, za katerega so predvideli da gre za pakirni signal, je lahko po transformaciji prišlo do homologne rekombinacije med ročicama preko tega zaporedja. Vektorsko ogrodje je na koncih nosilo 60 bp homologije na konca, ki sta nastala po rezanju s Cas9. Tako je v celici lahko prišlo do homologne rekombinacije med vektorskim ogrodjem in obema ročicama, kar pomeni da je po sestavljanju v celici prisotna celotna kopija fagnega genoma v krožni obliki. Uspešnost sestavljanja so preverili s PCR, genom JG024 je vsebovalo 6 od 10 preverjenih kolonij ''S. cerevisiae'' [1].

Poleg sestavljanja genoma iz izolirane fagne DNA, rezane s Cas9 so genom JG024 uspešno sestavili tudi iz treh PCR produktov [1]. Sestavljanje fagnih genomov iz PCR produktov omogoča preprosto urejanje, kar omogoča pridobivanje fagov s spremenjenimi lastnostmi kot je razširjeno gostiteljsko območje [5].  V tem primeru se je genom sestavil v 5 od 10 preverjenih kolonij. Preverili so tudi stabilnost genoma ob pasažah kvasovk, pri čemer so dokazali da je genom ostal stabilen v kvasovkah po desetih pasažah [1].

== Ponovni zagon genoma sestavljenega v ''S. cerevisiae'' ==
Sprva so raziskovalci poskusili z genomom, izoliranim iz kvasovk ''S. cerevisiae'', transformirati seva ''P. aeruginosa'' PA14 in PAO1. Ker so bili pri tem neuspešni, so postopek sestavljanja genoma in transformacije PA14 in PAO1 ponovili še z genomom faga DMS3, ki ima prav tako cirkularno permutiran genom. Fagni delci so nastali samo po transformaciji seva PAO1. Ker so raziskovalci predvidevali, da so za neuspešen ponovni zagon krivi obrambni sistemi (CRISPR, restrikcijsko-modifikacijski sistem, Wadjet), so genom JG024 poskusili ponovno zagnati v sevih z delecijami posameznih obrambnih sistemov . Za ponovni zagon genoma JG024 so najbolj konsistentne rezultate dosegli v sevu PA14, ki je imel deletirane vse tri prej omenjene sisteme (PA14 ∆CRISPR∆RM∆Wadjet). Te rezultati kažejo, da imajo lahko gostiteljski obrambni sistemi pomemben vpliv na ponovni zagon fagnih genomov [1].

Na ponovni zagon je imela vpliv tudi oblika fagne DNA. Linearno vektorsko ogrodje, uporabljeno za sestavljanje v kvasovkah je na obeh koncih vsebovalo prepoznavno mesto za restrikcijsko endonukleazo, ki po rezanju pusti tope konce. Tako so lahko po izolaciji cirkulariziranega genoma iz kvasovke fagni genom raziskovalci ločili od vektorskih elementov. Ponovno so lahko zagnali samo genom, ki so ga ločili od kvasnih elementov, cirkulariziranega genoma, ki je še vseboval vektor pa ne [1].

Po uspešnem ponovnem zagonu genoma JG024, so raziskovalci zgoraj opisane metode uporabili tudi pri ponovnem zagonu genomov treh drugih fagov, ki okužijo P. aeruginosa. To so bili DMS3 iz družine Casadabanvirus, F8 iz rodu ''Pbunavirus'' in vB_PaeP_PAO1_Ab05 iz družine Autographiviridae. Po kloniranju v S. cerevisiae so genoma F8 in vB_PaeP_PAO1_Ab05 uspešno ponovno zagnali v sevu PA14 ∆CRISPR∆RM∆Wadjet, DMS3 pa v sevu PAO1 [1].

== Vpliv ponovnega zagona na pojav mutacij  ==
Raziskovalci so želeli preveriti tudi, ali sestavljanje genoma v ''S. cerevisiae'' in njegov ponovni zagon v ''P. aeruginosa'' povzroči nastanek mutacij v fagnih genomih. To so preverili z določitvijo zaporedja celotnih ponovno zagnanih genomov dveh klonov DMS3 in dveh klonov JG024, ki so jih nato primerjali z zaporedji genomov fagov divjega tipa. Morebitne mutacije so razdelili na dva tipa, stohastične (mutacije, ki so nastale pri podvajanju fagov) in mutacije, ki so posledica uporabljenih metod (mutacije, ki so nastale pri sestavljanju v kvasovki). Posamezna stohastična mutacija je prisotna samo pri majhnem deležu fagov v populaciji, medtem ko so mutacije, ki so posledica metodologije prisotne pri večini fagov iz posameznega plaka. Pri dveh klonih JG024 so skupaj našli 7 stohastičnih mutacij, pri DMS3 pa 13 stohastičnih in eno mutacijo, ki je bila prisotna pri visokem deležu odčitkov. Ta mutacija se je nahajala na mestu, ki je bilo uporabljeno za rekombinacijo vektorja z fagnim genomov, kar hkrati z visokim deležem odčitkov nakazuje na to, da je ta mutacija nastala pri sestavljanju genoma v kvasovki. Te rezultati kažejo na to, da pride pri sestavljanju fagnih genomov v kvasovkah in sledečemu ponovnemu zagonu do uvedbe zelo majhnega števila mutacij [1].

== Zaključek ==

Razumevanje pogojev pod katerimi lahko ponovno zaženemo genome fagov, ki okužijo patogene bakterije, je pomemben korak k pridobivanju fagov s spremenjenimi lastnostmi. Taki fagi bi bili zaradi novih lastnosti kot so razširjeno gostiteljsko območje, odpornost na gostiteljeve obrambne sisteme in preprečevanje tvorbe biofilmov, bolj primerni za uporabo v fagni terapiji. V predstavljeni študiji so Ipoutcha in sodelavci, s kloniranjem fagnih genomov in njihovim ponovnim zagonom v ""Pseudomonas aeruginosa"", prvič uspeli ponovno zagnati fage, ki so sposobni okužiti patogene seve bakterije ''P. aeruginosa''. Pri tem so preučili vpliv različnih sevov, ki so bili uporabljeni za ponovni zagon, na njegovo učinkovitost. To predstavlja pomemben korak proti hitremu in učinkovitemu ponovnemu zagonu katerihkoli bakteriofagov, ki okužijo ''P. aeruginosa'' [1].

== Literatura ==

[1] 	H. E. Ipoutcha T, Racharaks R, Huttelmaier S, Wilson CJ, Ozer EA: A Synthetic Biology Approach to Assemble and Reboot Clinically Relevant Pseudomonas Aeruginosa Tailed Phages. Bacteriophages, 2024, 12.

[2] 	M. Mahler, A. R. Costa, S. P. B. van Beljouw, P. C. Fineran, S. J. J. Brouns: Approaches for Bacteriophage Genome Engineering. Trends Biotechnol, 2023, 41, 669–685.

[3] 	D. G. Gibson, G. A. Benders, K. C. Axelrod, J. Zaveri, M. A. Algire, M. Moodie, M. G. Montague, J. C. Venter, … C. A. Hutchison: One-Step Assembly in Yeast of 25 Overlapping DNA Fragments to Form a Complete Synthetic Mycoplasma Genitalium Genome. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105, 20404–20409.

[4] 	J. E. Dicarlo, A. J. Conley, M. Penttila, J. Ja, H. H. Wang, G. M. Church: Yeast Oligo-Mediated Genome Engineering (YOGE). ACS Synth. Biol., 2013, 2, 741–749.

[5] 	H. Ando, S. Lemire, D. P. Pires, T. K. Lu: Engineering Modular Viral Scaffolds for Targeted Bacterial Population Editing. Cell Syst, 2015, 1, 187–196.