View source for Identifikacija genov, ki se odzivajo na stres kislega okolja in inženiring odpornosti na kislo okolje v cianobakteriji Synechococcus elongatus PCC 7942

Izhodiščni članek: [https://link.springer.com/article/10.1007/s00253-023-12984-5 Identifikacija genov, ki se odzivajo na stres kislega okolja in inženiring odpornosti na kislo okolje v cianobakteriji ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942]
==Uvod==
''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 je modelna enocelična cianobakterija, ki se pogosto uporablja za preučevanje fotosinteze in cirkadianih ritmov ter v sintezni biologiji za proizvodnjo različnih biogoriv in kemikalij, ki so ključne za uporabo v različnih industrijah (farmacevtska, avtomobilska, prehrambena). Vendar pa kisla okolja, kot so zakisana jezera, potoki in kisli dež, predstavljajo veliko omejitev v produktivnosti cianobakterije, saj se rast celic pri pH 5,5 skoraj ustavi, kar močno omejuje njeno vsestransko uporabo. Namen študije je odkriti, kateri diferenčno izraženi geni (''angl.'' differentially expressed genes, DEG) so ključni za odziv na stres kislega okolja (v nadaljevanju kislinski stres) in poskusiti razumeti mehanizem odpornosti nanj [1],[2].

==Delo in metode==
Za dosego pogojev dolgotrajnega kislinskega stresa so celice gojili v gojišču BG11 z dodatkom MES (hidrat 4-morfolin etan sulfonske kisline) do dosege pH vrednosti 5,7. Celice so gojili 60 ur. Kontrolne celice so gojili v istem gojišču pri pH vrednosti 7,5 brez dodatka MES. Za dosego kislinskega šoka pa so celice 60 ur gojili v gojišču BG11 (brez dodatka MES) pri pH 7,5, nato pa so dodali HCl, da so dosegli pH vrednost 5,7 ter celice gojili še 1 uro. Kontrolne celice so gojili v istem gojišču pri pH 7,5, vendar jim niso dodali HCl. Nato so zbrali vzorce in izvedli RNA sekvenciranje (RNA-seq) in qRT-PCR, da so določili ekspresijski nivo genov pri normalnih pogojih in v pogojih kislinskega stresa (dolgotrajni kislinski stres in kislinski šok). Na podlagi rezultatov so sintetizirali različne seve, pri čemer so imeli nekateri sevi izbite posamezne gene, nekateri so imeli te gene ponovno vnesene, nekateri sevi pa so imeli prekomerno izražene določene gene [1].

==Rezultati in razprava==

===Transkriptomska analiza na osnovi RNA-seq za proučevanje odziva na kislinski stres===
Najprej so izvedli transkriptomsko analizo na osnovi RNA-seq, da bi odkrili, kateri DEG-i in kateri mehanizmi so pomembni pri odpornosti na kislinski stres. Najprej so na osnovi rezultatov genske ekspresije izdelali analizo glavnih komponent (PCA) in ugotovili, da so različni pogoji (kontrola, dolgotrajni stres, kislinski šok) tvorili tri različne skupke. Nato so identificirali nadizražene in podizražene gene pri dolgotrajnem kislinskem stresu v primerjavi s kontrolo in ugotovili, da je bilo skupno 927 DEG, od tega 459 nadizraženih in 468 podizraženih genov. Analizirali so tudi take gene pri kislinskem šoku v primerjavi s kontrolo ter ugotovili, da je bilo skupno 1170 DEG-ov, od tega je bilo 544 nadizraženih, 626 pa podizraženih genov. Nato pa so med seboj primerjali še dolgotrajni kislinski stres in kislinski šok ter ugotovili, da je bilo pogojema skupnih 229 nadizraženih genov in 227 podizraženih genov. Določitev vseh DEG-ov jim je služila, da so s KEGG analizo določili 20 glavnih obogatenih metabolnih poti, v katerih so vključeni določeni DEG-i [1]. 

===Identifikacija DEG-ov, ki so vključeni v glavne obogatene metabolne poti===
Najbolj so jih zanimale glavne obogatene metabolne poti, v katere so bili vključeni nadizraženi geni pri dolgotrajnem kislinskem stresu v primerjavi s kontrolo. Glavne poti so vključevale dvokomponentni sistem, presnovo dušika, razgradnjo RNA, presnovo porfirina in klorofila ter transporterje ATP-vezavne kasete (ABC transporterji) [1].

Pri dvokomponentnem sistemu so odkrili 12 nadizraženih genov, pri katerih je vredno omeniti dva, to sta  ''cikA'' in ''pixJse''. Prvi gen kodira za protein cikA, ki je ključnega pomena pri uravnavanju bakterijskih cirkadianih ritmov in se odziva na zunanje okoljske signale, ki vplivajo na redoks stanje celice. Drugi gen pa kodira za protein pixJSe, ki zaznava modro in zeleno svetlobo ter je pomemben za pozitivno fototaktično gibljivost, kar je bistveno za zagotavljanje optimalne fotosintezne učinkovitosti. Ugotovitev nakazuje, da sta gena pomembna pri odzivu na spremembe zunanjih okoljskih signalov, vključno z znižanjem pH vrednosti. Naslednja obogatena pot je bila presnova dušika, ki je ključnega pomena za ohranjanje ustreznega ravnotežja med ogljikom in dušikom ter je pomembna pri pojavu evtrofikacije v vodnih ekosistemih. Med nadizraženimi geni so bili najpomembnejši geni, ki kodirajo za proteine, vključene v NrtABCD kompleks. Ta je ključen za sprejem in prenos nitrata ter protonov. V eni izmed drugih študij so pokazali, da je kompleks pomemben tako za nadzor transmembranskega prehoda protonov kot tudi za razvoj odpornosti na kislo okolje s črpanjem H+ ionov iz gojišča in pretvorbo nitrata v amoniak [1].

Najpomembnejša obogatena pot pa je bila ABC transportna pot. Pri tej poti so pri dolgotrajnem kislinskem stresu v primerjavi s kontrolo identificirali 15 nadizraženih genov. ABC transporterji so glavni membranski transportni sistemi v cianobakterijah, kjer je pri prenosu substratov ključna hidroliza ATP. Delujejo lahko kot importerji, ki v celico prinašajo hranila in druge potrebne molekule, lahko pa delujejo kot eksporterji, ki pomagajo pri izločanju strupenih snovi iz celice in vzdrževanju celične homeostaze. To je ključno za zaščito celice pred abiotskim stresom ter drugimi neugodnimi okoljskimi razmerami. ABC transporterji so sestavljeni iz dveh transmembranskih domen, ki sta vgrajeni v membranski dvosloj in dveh ABC domen, ki sta prisotni na citoplazemski strani. Importerji so odvisni še od vezavnega proteina, ki v periplazmi veže ligand in ga prinese do transporterja [1],[3].

===Podrobnejša analiza šestih genov, ki so vključeni v ABC transportno pot===
Z analizo izbitja enega gena so podrobneje analizirali šest genov, ki so ključni za uravnavanje odpornosti na kislinske pogoje. Določeni geni so bili: ''chIL'', ''chIN'', ''pex'', ''synpcc7942_2038'', ''synpcc7942_1890'' in ''synpcc7942_2547''. Gen ''chlL'' kodira za železovo-žveplov ATP vezavni protein, ki je del od svetlobe neodvisne protoklorofilne reduktaze, ''chlN'' pa kodira za njeno N podenoto. V cianobakterijah je klorofil II pomemben za odziv na različne okoljske stresne pogoje, medtem ko je železo pomemben pri procesu fotosinteze in njegova razpoložljivost neposredno vpliva na sintezo klorofila. Ugotovitve nakazujejo, da oba gena vplivata na kislinski stres preko regulacije fotosintetskega sistema [1].

Naslednja dva gena sta bila ''pex'' in ''synpcc7942_2038'', ki spadata v družino HTH (''ang.'' helix-turn-helix) transkripcijskih regulatorjev. Gen ''pex'' kodira za cirkadiani elongator, ki tvori dimer in služi kot negativni regulator proteina kaiA. Dokazano je bilo, da inaktivacija gena ''pex'' povzroči agregacijo kaiA mRNA, kar povzroči skrajšan cirkadiani cikel. Hkrati pa sistemi, ki nadzorujejo cirkadiani ritem sodelujejo tudi pri odzivu na osmotski stres. Gen ''synpcc7942_2038'' je član družine ksenobiotičnih odzivnih elementov (XRE) in je podoben transkripcijskemu regulatorju SutR v ''E. coli''. SutR uravnava izražanje genov, ki so pomembni za poti, ki sodelujejo pri asimilaciji železa. V eni od študij so pokazali, da je asimilacija železa v bakteriji ''Corynebacterium glutamicum'' ključna za odpornost proti kislinskemu stresu. Zadnja dva gena sta ''synpcc7942_1890'' in ''synpcc7942_2547'', katerih funkcija žal ni znana, vendar sta pomembna pri regulaciji odpornosti organizma na kislinske pogoje [1]. 

===Posamično izbitje šestih genov, pomembnih za odpornost na kislinski stres===
Da bi proučili, če so omenjeni geni pomembni pri odpornosti na kislinski stres, so pripravili šest različnih sevov, v katerih so izbili po enega od šestih genov. Nato so mutante in divji tip (WT) gojili v gojišču BG11 pri pH 7,5 in pH 5,6 ter opazovali razlike v rasti celic. Za nadaljnje preverjanje vpletenosti teh genov pri odpornosti na kislinski stres so naredili komplementarne seve, kar pomeni, da so v mutante nazaj vnesli zapise za posamezne gene pod kontrolo promotorja Pcpc560. Gre za močan promotor, sestavljen iz dveh promotorjev, katerih zapis izhaja iz gena ''cpcB'' iz ''Synechocystis sp.'' 6803 ter iz 14 vezavnih mest za transkripcijske faktorje. Komplementarne seve so gojili pri enakih pogojih kot mutante [1],[4]. 

Analiza rasti celic je pokazala, da so v gojišču BG11 pri pH 7,5 vse mutante in njihovi komplementarni sevi zrastli enako kot WT, kar je pomenilo, da izbitje šestih genov in njihova komplementacija niso imeli negativnih vplivov na rast celice pri normalnih pH pogojih. Analiza rasti v gojišču BG11 pri pH 5,6 pa je pokazala, da je bila rast mutiranih sevov močno zavrta v primerjavi z WT, medtem ko se je rast komplementarnih sevov skoraj približala rasti WT. Rezultati nakazujejo, da so omenjeni geni ključni za odpornost proti kislinskemu stresu [1]. 

===Inženiring odpornosti cianobakterije na kisle pogoje s prekomernim izražanjem genov ''chlL'' in ''chlN''===
V končnem eksperimentu so v WT izvedli še prekomerno izražanje posameznih šestih genov. Analiza odpornosti v kislih pogojih je pokazala, da je odpornost povečalo posamezno prekomerno izražanje le dveh od šestih genov, in sicer genov ''chlL'' in ''chlN'' [1].

==Zaključek in nadaljnje raziskave==
Z vidika sintezne biologije bi izboljšava odpornosti na kislinski stres v cianobakteriji ''S. elongatus'' PCC 7942 služila za večjo produktivnost in robustnost organizma. V prihodnosti bi lahko študijo nadgradili tako, da bi raziskali, pri kateri temperaturi, slanosti, količini razpoložljivosti hranil ali količini svetlobe pride do zmanjšane produktivnosti cianobakterij. Zopet bi lahko identificirali DEG-e, ki so vključeni v obogatene metabolne poti in sintetizirali seve, ki bi bili odporni na določene okoljske pogoje. 

==Viri==
[1]	J. Zhang, T. Sun, W. Zhang, L. Chen: Identification of acidic stress-responsive genes and acid tolerance engineering in Synechococcus elongatus PCC 7942. Appl Microbiol Biotechnol 2024, 108, 1–11.

[2]	A. Parmar, N. K. Singh, A. Pandey, E. Gnansounou, D. Madamwar: Cyanobacteria and microalgae: A positive prospect for biofuels. Bioresource Technology. November 2011, pp 10163–10172.

[3]	D. C. Rees, E. Johnson, O. Lewinson: ABC transporters: The power to change. Nature Reviews Molecular Cell Biology. March 2009, pp 218–227.

[4]	J. Zhou, H. Zhang, H. Meng, Y. Zhu, G. Bao, Y. Zhang, Y. Li, Y. Ma: Discovery of a super-strong promoter enables efficient production of heterologous proteins in cyanobacteria. Sci Rep 2014, 4.