View source for CELPro

Projekt cELPro je inovativna oblika zdravljenja kronične vnetne bolezni prebavil znane kot sindrom razdražljivega črevesja, ki ga je za tekmovanje iGEM razvila ekipa iz Eindhovna na Nizozemskem. Za svoj projekt so na tekmovanju leta 2023 prejeli zlato medalijo. 
https://2023.igem.wiki/tu-eindhoven/description

==Uvod==
Približno 4,9 milijona ljudi po svetu trpi za sindromom razdražljivega crevesja (IBD). Gre za kronično vnetno bolezen gastrointestinalnega trakta. Spekter simptomov je širok in pri različnih pacientih nekoliko različen, največkrat gre za bolečine v predelu trebuha, kri v blatu, nenadna izguba teže in izčrpanost, ki lahko traja več dni [1,2]. Vzroki za nastanek IBS niso poznani, trenutno prevladuje mnenje, da gre za okvaro v osi možgani-prebavila. Bolezen lahko sprožijo bakterijske ali glivne okužbe ali kronično pomanjkanje vitamina D. Obstajajo dokazi, da je IBS vsaj deloma pogojen tudi genetsko [3]. Število bolnikov iz leta v leto narašča, porast je izrazit predvsem v zahodnih, industrializiranih državah. Pacienti so največkrat mlajši, bolezen se pogosteje pojavlja pri ženskah [4].Trenutne terapije za IBS
Trenutno se IBD zdravi, ko nastopi izbruh bolezni. Zdravljenje je predvsem simptomatsko, preventivno zdravljenje ne obstaja. Največkrat se uporablja kombinacija 5-aminosalicilne kisline in kortikosteroidov. Redkeje se uporablja kombinacija 5-aminosalicilne kisline in protiteles proti faktorju tumorske nekroze alfa. V primeru, da je IBD povzročila bakterijska okužba se za zdravljenje uporabljajo antibiotiki v kombinaciji z imunomodulatorji [5].
Pacinetom se v izogib izbruhom oz. za blažje izbruhe priporoča tudi dieta bogata z vlakninami [6]. Tudi najboljše terapije, ki so trenutno na voljo so uspešne pri zgolj 50 % pacientov. Pogosto jih spremljajo tudi številni neželeni stranski učinki [7]. IBS poleg vpliva na kvaliteto življenja pacientov predstavlja tudi veliko finančno breme, ocene letne zdravstvene oskrbe enega pacienta v ZDA se gibljejo v okolici 26.000 dolarjev [8].

==Projekt cELPro==
Načini zdravljenja IBS, ki so na voljo trenutno so dragi, pogosto neučinkoviti in imajo veliko stranskih učinkov. Prav tako pa ne preprečujejo izbruhov.  Raziskovalna ekipa iz univerze v Eindhovnu na Nizozemskem je zato razvila alternativen pristop k zdravljenju. Pripravili so gensko spremenjene celice bakterij Escherichia coli, s čemer so jih spremenili v probiotik. V celice so vstavili dva različna plazmida. Prvi nosi zapis za elastinu podoben polimer (ELP), drugi pa nosi zapis za interlevkin 10 (IL-10). ELP v celici spontano polimerizira, kar omeji bakterijsko rast. Sproščanje interlevkina v črevesju pa ublaži vnetje v črevesju. Zdravilo je pripravljeno v obliki capsule, ki vsebuje liofilizirane gensko spremenjene bakterijske celice. Kapsula je odporna na kisle pogoje v želodcu, kar omogoča, da bakterije črevesje dosežejo nepoškodovane. 

===ELP===
ELP so proteinski polimeri izpeljani iz človeškega tropoelastina. Njihova ključna lastnost je, sponatana, od temperature odvisna polimerizacija. Afiniteto do polimerizacije so povečali tako, da so na N- in C-konca ELP dodali levcinski zadrgi.
Vzorci ostajajo topni do temperatue prehoda in, ko je ta dosežena tvorijo micele, ki v nadaljevnaju tvorijo sferične agregate. Polimeri niso imunogeni, razgraditi pa jih je mogoče s proteolizo. Splošno aminokislinsko zaporedje polimerov ELP je (VPGXG)^n. Pri tem je X variabilna aminokislina, ki vpliva na lastnosti polimera, kot so stabilnost in temperature prehoda. Skupine TU-Eindhoven je uporabila polimere z zaporedjei (VPGIG)^n in ((VPGAG)3(VPGGG)2)^n. `
===IL-10===
IL-10 je protivnetni citokin, ki gra proizvaja večina imunskih celic. Omejuje prekomerno delovanje imunskega sistema med okužbami, alergijskimi reakcijami in avtoimunimi obolenji. Prevelika količina IL-10 v organizmu lahko vodi v razvoj kroničih okužb, kar je glavni razlog, da se sistemski vnos IL-10 ne uporablja za zdravljenje IBD. Poleg povečanega tveganja za razvoj oportunističnih okužb pa se pri sistemskem vnosu IL-10 v črevo lokalizira premajhna količina interlevkina, da bi dosegel terapevtski učinek.

==Laboratorijsko delo==
===Kloniranje konstruktov in izražanje ELP===
Pripravili so konstrukte DNA, ki so zapisovali za ELP, z Leu zadrgama na obeh koncih. Tako pripravljen gen so z ligacijo vstavili v prazen vektor pET24a(+) in ga s procesom transforacije vstavili v celice E. coli seva BL21(DE3). Viabilnost bakterijskih celic po zamreženju gela v citoplazmi so pokazali tako, da so pripravili vektorkski konstrukt, protein v obliki fuzije med ELP in reportejem nNeonGreen. 

===Preverjanje viabilnosti celic===
Raziskovalci so želeli preveriti pri kakšnem deležu celic v kulturi pride do upočasnjene delitve po znotrajcelični polimerizaciji. V ta namen so uporabili Cell clunting kit 8 (CCK8), s katerim lahko določamo število viabilnih celic v vzorcu. Test so izvajali v kombinaciji s prisotnostjo ampicilina. Raziskali so tudi vpliv zamrzovnaja v tekočem dušiku in liofilizacije na viabilnost celic. Ampicilin je ireverzibilni inhibitor encima transpeptidase, ki je ključna za tvorbo celične stene in tako ubija bakterije samo ko se delijo [9]. Hipoteza raziskovalcev je bila, da v primeru, če znotrajcelicno zamrezenje res ustavi delitev bi moral preživeti večji delež bakterijskih celic, kot pri kontrolah, kjer do zamreženja ni prišlo.  Ugotovili so, da v kulturah kjer niso inducirali izražanja ELP, odmre večji delež celic, kot v kulturah, kjer so izražanje inducirali. Celice z izraženim in polimeriziranim ELP so še vedno odmirale, kar pomeni, da zamreženje upočasni delitev, vendar je ne zaustavi popolnoma.

===Priprava IL-10===
Kot terapevtsko sredstvo so izbrali protivnetni interlevkin IL-10. Glavna težava na katero naletimo pri izražanju tega proteina v bakterijskih celicah je, da vsebuje disulfidne mostičke. Protein je zato potrebno izraziti v periplazemskem prostoru. Kot lokalizacijaki signal, ki je usmerjal rekombinantni IL-10 v periplazmo so uporabili zaporedje Ompf, konstrukt so z ligacijo vnesli v vektor pBAD. Plazmid so procesom transformacije vnesli v celice E. coli (DE3). Izolirano frakcijo iz periplazme so analizirali z Na-DS PAGE, vendar niso opazili pričakovane lise pri velikosti 18.3 kDa. Izvedli so še imunodetekcijo, ki je bolj občutljiva metoda. Zaznali so razliko med kontrolami in vzorci izoliranimi iz periplazme, vendar iz pridobljenih rezultatov niso mogli določiti koncentracije izraženega IL-10.  Tako so zaključili, da je najverjetneje prišlo do izražanja IL-10, vendar v tako majhni količini, da ga s klasičnimi metodami niso uspeli zaznati. Izražanje v tako majhnem obsegu najverjetneje nebi imelo nobenega terapevtskega učinka. 

==Prednosti projekta cELPro==
Prednost metode zdravljenja IBS, ki so ga razvili v sklopu tega projekta je, dostava zdravila na tarčno mesto. Tega z intravnoznim dodajanjem IL-10 ni mogoče doseči. Druga prednost je, da se lahko pacient zdravi v udobju lastnega doma, kar razbremeni bolnišnice. 

==Zaključek==
IBD močno vpliva na kvaliteto življenja pacientov, trenutni načini zdravljenja so precej nezanesljivi. Razvoj novih načinov zdravljenja, ki so bolj učinkoviti in imajo manj stranskih učinkov je tako ključnega pomena. Ekipa iz Eindhovna je razvila obetavno metodo zdravljenja, ki vključuje celice E. coli, ki izražajo protivnetni IL-10. Prekomerno rast celic pa so omejili tako, da so v celicah poleg IL-10 izrazili še ELP, ki znotraj celice spontano polimerizira in tako upočasni delitev celic, hkrati pa celice ostanejo viabilne. Glavna prednost tega dostavnega sistema je, da se IL-10 sprošča lokalno, ker pomeni da je za učinkovito delovanje potrebna manjša koncentracija, potencialni stranski učinki pa so minimizirani. Ostaja še nekaj prostora za izboljšavo oziroma optimizacijo izdelka. Zaradi časovnih omejitev niso uspeli dodelati sistema za izražanje IL-10, kar je ključnega pomena za učinkovitost.

==Viri==
[1] “What is inflammatory bowel disease (IBD)? | IBD.” https://www.cdc.gov/ibd/what-is-IBD.htm 25.5.2024

[2] R. Wang, Z. Li, S. Liu, and D. Zhang, “Global, regional and national burden of inflammatory bowel disease in 204 countries and territories from 1990 to 
2019: a systematic analysis based on the Global Burden of Disease Study 2019,” BMJ Open, vol. 13, no. 3, p. e065186, Mar. 2023, doi: 10.1136/BMJOPEN-2022-065186.
[3] G. Locke, R. Choung, “Epidemiology of IBS”, Gastroenterology Clinics of North America, vol. 40, no 1, p 1-10, 2011, doi: 10.1016/j.gtc.2010.12.006.

[4] “Understanding and Preventing the Global Increase of Inflammatory Bowel Disease,” 2017, doi: 10.1053/j.gastro.2016.10.020.

[5].  H. Hadji and K. Bouchemal, “Advances in the treatment of inflammatory bowel disease: Focus on polysaccharide nanoparticulate drug delivery systems,” Adv. Drug Deliv. Rev., vol. 181, p. 114101, 2022, doi: 10.1016/j.addr.2021.114101.

[6] “Diet, lifestyle and medicines - Irritable bowel syndrome (IBS)” https://www.nhs.uk/conditions/irritable-bowel-syndrome-ibs/diet-lifestyle-and-medicines/ 25.5.2024

[7] G. Roda, B. Jharap, N. Neeraj, and J. F. Colombel, “Loss of Response to Anti-TNFs: Definition, Epidemiology, and Management,” Clin. Transl. Gastroenterol., vol. 7, no. 1, p. e135, Jan. 2016, doi: 10.1038/CTG.2015.63.

[8] B. B. Rao et al., “The Cost of Crohn’s Disease: Varied Health Care Expenditure Patterns Across Distinct Disease Trajectories,” Inflamm. Bowel Dis., vol. 23, no. 1, pp. 107–115, Jan. 2017, doi: 10.1097/MIB.0000000000000977.

[9] E. L. Foltz, J. W. West, I. H. Breslow, and H. Wallick, “Clinical pharmacology of pivampicillin.,” Antimicrob. Agents Chemother., vol. 10, no. 3, pp. 442–454, 1970, doi: 10.47363/jprsr/2022(3)129.