View source for SynPlode

[https://2024.igem.wiki/epfl/ SYNPLODE] je iGEM projekt ekipe EPFL iz Švice iz leta 2024. 

==Uvod==
Cilj je bil izdelati sistem za nevtralizacijo eksplozivov kot so mine in druga neeksplodirana sredstva oz. UXO (ang. unexploded ordnance) v povojnih območjih. Pregled območij in odstranjevanje min je počasen, drag in nevaren proces. Problem je tudi, da minska polja niso uporabna v agrikulturi [1]. Kontaminacija z eksplozivi sicer ni pogosta le na povojnih območjih, temveč problem predstavljajo tudi odpadni produkti na območjih tovarn, kjer izdelujejo eksplozive. Ta odpad se prenaša v prst in zaide v vodne sisteme [2]. 

Rešitev, ki jo je zasnovala ekipa EPFL, so gensko spremenjene bakterije, ki so sposobne detekcije in razgradnje dveh najpogosteje uporabljenih eksplozivov v minah: TNT (2,4,6-trinitrotoluen) in RDX (1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin oziroma ciklonit). Za varen doseg teh območij in razporeditev bakterij so dizajnirali bio-dron. Proces nevtralizacije eksplozivov so razdelili na tri faze: detekcijo kontaminiranih območij, razgradnjo TNT in RDX in kontrolo uspešnosti nevtralizacije [1]. 

==1.	Detekcija kontaminiranih območij==
Območje, kjer se verjetno nahajajo neeksplodirana sredstva, bi poškropili z bakterijami za detekcijo in nato območje poskenirali z bio-dronom. Za detekcijo bi uporabili bakterije iz iGEM projekta leta 2020 ekipe NEFU iz Kitajske. Te bakterije so bile gensko spremenjene tako, da ob stiku z eksplozivi fluorescirajo [1]. 

==2.	Razgradnja TNT in RDX==
Bio-dron cone, ki jih je zaznal kot kontaminirane, poškropi z bakterijami ''E. coli'' za razgradnjo eksplozivov TNT in RDX. Zasnovali so dva konstrukta. Kot ekspresijski sev so izbrali bakterije ''E. coli'' BL21, ki so jih gojili v mediju LB. Delovanje konstruktov so testirali z merjenjem koncentracije eksplozivov v mediju z metodo LC-MS in merjenjem fluorescence reporterskih proteinov [1]. 

===Razgradnja TNT===
Znano je, da so številne bakterije (Pseudomonas, Stenotrophomonas, Bacillus…) sposobne razgraditi TNT. Encimi, ki pri tem sodelujejo so v glavnem nitroreduktaze in encimi družine OYE (ang. old yellow enzyme family). Pri projektu SYNPLODE so zasnovali konstrukt, ki omogoča povečano izražanje treh encimov. NfsA in NfsB sta nitroreduktazi, ki lahko reducirata do eno ali dve nitro skupini na aromatskem obroču. Pri tem lahko nastanejo hidroksilaminodinitrotoluen (HADNT), aminodinitrotoluen (ADNT) ali diaminonitrotoluen (DANT). NemA je ksenobiotska N-etilmaleimid reduktaza iz družine OYE. Tudi ta reducira nitro skupino na aromatskem obroču, pri čemer se sprosti nitrit [2].  

Za zaznavanje TNT, DNT in razgradnega produkta dihidroksitoluena (THT) so izbrali inducibilni promotor ygjF3rd. Gre za modificiran promotor, ki naj bi bil 5× bolj občutljiv kot divji tip, a so že na začetku naleteli na težavo, ker se promotor ni odzival na TNT. Verjetno je izgubil občutljivost na TNT, ker ga je iGEM ekipa NEFU leta 2020 optimizirala za DNT. Ko so testirali razgradnjo TNT so ugotovili, da bakterije iz medija takoj prevzamejo določeno koncentracijo TNT. Ta je namreč hitro padla iz 70 μg/ml na 30 μg/ml. Razgradnja je bila hitrejša, če so encime izražali pod konstitutivnim promotorjem J23100, a konstitutivnega izražanja nfsA zaradi neuspešnega prenosa western niso mogli potrdit  [1].

Prav tako so uporabili transkripcijski aktivator yhaJ1st in ga izražali pod konstitutivnim promotorjem J23100. V konstrukt so navzdol od zapisov za encime dodali še zapis za modri fluorescenčni protein Electra2.  Služil jim je kot reporter promotorskega delovanja, v končnem produktu pa senzor za detekcijo TNT. Kasneje bi Electro2 zamenjali z luciferazo Cypiridina, ki oddaja bolj živo modro barvo in omogoča detekcijo brez vzbujanja [1].  

===Razgradnja RDX===
XplA je citokromu P450 podoben gen. Pri aktivaciji XplA sodeluje reduktaza xplB, ki iz NADPH prenese elektrone na flavodoksinsko domeno XplA [3]. Točen mehanizem razgradnje RDX še ni poznan. Najverjetneje v anaerobnih pogojih pride do mono-denitracije, monohidracije in cepitve obroča pri čemer nastane metilendinitramin. V aerobnih pogojih pa pride do di-denitracije, di-hidracije in cepitve, ki vodi v nastanek 4-nitro-2,4-diazabutanala. V obeh primerih je stranski produkt še formaldehid [4]. 

Za izražanje so izbrali konstitutivni promotor J23100 in na translacijskem nivoju regulacijo z RNA stikali občutljivi na RDX. Kot reporter so izbrali mNeonGreen, ki v prisotnosti RDX omogoča, da bakterije svetijo zeleno. Tudi tega bi v nadaljevanju zamenjali z zeleno luciferazo Renilla, ki bi omogočila detekcijo brez vzbujanja fluorescence [1].

Pri testiranju konstrukta do razgradnje RDX ni prišlo. Prvotno RNA stikalo ni bilo dovolj občutljivo za RDX, kar je bila najverjetneje posledica mutacij in izguba nekaterih genetskih elementov, zato so izbrali drug klon, ki omogoča boljšo ekspresijo, a je tudi bolj podvržen puščanju. Zaradi neuspešnega kloniranja niso nadaljevali z eksperimenti [1]. 

===Preživetje bakterij===
Uporaba gensko spremenjenih organizmov v naravi je tvegana, zato so zasnovali mehanizem kill-switch, ki se v bakterijah aktivira šele v drugi fazi nevtralizacije, torej ko se bakterijska kultura razprši po območju kontaminiranem z eksplozivi. Bakterije bi zato preživele le v prisotnosti TNT in RDX. Mehanizem temelji na sistemu toksin-antitoksin tipa II CcdA/CcdB [1]. 
CcdB je toksin, ki se v celicah od začetka druge faze izraža konstitutivno. Gen za Ccd8 so klonirali v nasprotni smeri glede na promotor J23100 (antisense), navzgor in navzdol pa so vstavili prepoznavna mesta za rekombinazo Cre (loxP in lox2272). Tik pred uporabo bakterij v drugi fazi nevtralizacije je zato potrebno v celični medij dodat teofilin, ki preko RNA stikala omogoča izražanje rekombinaze Cre. Le-ta potem izreže gen Ccd8 in ga obrne. Metoda, ki omogoča pogojeno izražanje toksina Ccd8, se imenuje FLEx switch oziroma flip-excision switch. Proti CcdB deluje antitoksin CcdA. Njegovo izražanje so sklopili s promotorjem ywjF3rd, ki ga inducira TNT, ter RNA stikalom odvisnim od RDX. Ko je proces razgradnje eksplozivov končan, se antitoksin ne proizvaja več. Takrat toksin Ccd8 inhibira delovanje DNA giraze, kar povzroča dvojne prelome DNA in vodi v celično smrt [1]. 

Po transformaciji plazmida v sev DH5α in sekvenciranju so opazili, da zapis za CcdB manjka, LoxP prepozvnavna mesta pa so bila prisotna. Teofilinsko RNA stikalo je puščalo, zato se je rekombinaza Cre v majhni količini izražala ves čas in izrezala zapis za CcdB. Puščanje RNA stikala vseeno ni zadoščalo za indukcijo izražanja CcdA, da bi lahko zaviral delovanje konstitutivno izraženega Ccd8 [1].

V času druge faze nevtralizacije bakterije za preživetje in rast porabljajo razgradne produkte TNT in RDX, ki predstavljajo vir dušika. Rezultati predhodne raziskave kažejo, da so v mediju, kjer je TNT bil edini vir dušika, celice prvih 12h rastle izredno hitro. Kasneje, ko se je tudi koncentracija TNT zmanjšala, se je rast počasi ustavila [2]. Ker lahko traja nekaj ur preden bakterije dosežejo mino in se aktivira sinteza antitoksina, so preko teofilinskega stikala dodatno omogočili še njegovo izražanje. Predlagali so tudi avksotrofijo za aminokisline. V prsti je koncentracija aminokislin dovolj nizka, da to bakterijam po končani razgradnji TNT in RDX ne bi omogočilo nadaljnjega preživetja.  Je pa potrebno v medij dodati aminokisline prej, da bakterije preživijo pot do mine [1]. 

==3.	Kontrola uspešnosti nevtralizacije==
Za čim boljšo zanesljivost kontrole so zasnovali logično vezje, ki poda povratno informacijo o razgradnji TNT in RDX tako, da bakterije svetijo rdeče, hkrati pa sistem še dodatno preveri, če so v zemlji prisotni stranski produkti reakcije kot je formaldehid. Naredili so dve vezji po principu 2-input AND, kjer vhodne in izhodne signale predstavljajo promotorji. Vsako vezje vključuje dva vhodna signala pod kontrolo katerih je izražanje transkripcijskega aktivatorja in šaperona. Skupaj aktivirata izhodni promotor. V različnih bakterijah je bilo v predhodnih raziskavahodkritih več parov aktivator-šaperon. Skupina EPFL je izbrala par z aktivatorjem MxiE in šaperonom IpgC, za drugo vezje pa transkripcijski faktor InvF in šaperon SicA [1],[5].

V prvem vezju en vhodni signal predstavlja promotor ygjF3rd, ki je aktiven v prisotnosti TNT. Pod kontrolo istega promotorja je navzdol od genov za razgradne encime še zapis za AraC. V odsotnosti TNT se represor AraC ne more izražat in vezat na promotor pBAD. Pod kontrolo pBAD se zato lahko prepiše gen za IpgC. V istem vezju je še en vhodni signal, ki ga predstavlja promotor J23100, ki je aktiven v prisotnosti RDX. Navzdol od zapisov za razgradne encime se za RNA stikalom nahaja še zapis za gen TetR. Le-ta sev odsotnosti RDX ne more prepisovat, kar aktivira promotor pTet, pod kontrolo katerega je zapis za transkripcijski aktivator MxiE. IpgC in MxiE tako ne moreta aktivirat promotorja pipaH*, ki sicer predstavlja enega izmed vhodnih signalov za spodnje vezje. Pod njegovo kontrolo pa se izraža šaperon SicA. Drug vhodni signal za spodnje vezje je konstitutivni promotor frm. Po razgradnji eksplozivov prisoten formaldehid inhibira represor frmR, ki se sicer konstitutivno izraža pod kontrolo promotorja J23100. V odsotnosti represorja promotor frm predstavlja drugi vhodni signal za spodnje vezje. Pod njegovo kontrolo se izraža transkripcijski aktivator InvF. Skupaj SicA in InvF aktivirata promotor psicA, kar omogoči izražanje rdečega fluorescenčnega proteina mScarlet. Bakterije, ki svetijo rdeče, so indikator uspešne nevtralizacije eksplozivnih sredstev. Logičnega vezja eksperimentalno niso uspeli testirati [1]. 

==Zaključek==
Tekom eksperimentalnega dela je ekipa EPFL naletela na nekaj težav, ki jih zaradi pomanjkanja časa niso uspeli rešit. Največji problem je predstavljalo izražanje encimov za razgradnjo TNT zaradi neobčutljivosti promotorja. Predlagali so, da bi v nadaljnih raziskavah uporabili divji tip promotorja yqjF ali pa konstitutivni promotor z RNA stikalom. Prav tako bi bilo potrebno eksperimentalno preverit delovanje drugega klona RNA stikala za RDX in delovanje logičnega vezja [1]. 

==Viri==
[1] EPFL - Swiss Federal Institute of Technology Lausanne. SYNPLODE. 2024. [citirano 1.4.2024]  https://2024.igem.wiki/epfl/

[2] Y. Li, J. Luo, X. Liao, H. Cao, J. Pan, A. James, H. Li: Multiomics insights into the TNT degradation mechanism by Pantoea sp. BJ2 isolated from an ammunition destruction site. Chemical Engineering Journal, 2024, 497, 154957.

[3] D. K. Sabir, N. Grosjean, E. L. Rylott, N. C. Bruce: Investigating differences in the ability of XplA/B-containing bacteria to degrade the explosive hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine (RDX). FEMS Microbiol Lett, 2017, 364.

[4] R. G. Jackson, E. L. Rylott, D. Fournier, J. Hawari, N. C. Bruce: Exploring the biochemical properties and remediation applications of the unusual explosive-degrading P450 system XplA/B. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2007, 104, 16822–16827.

[5] T. S. Moon, C. Lou, A. Tamsir, B. C. Stanton, C. A. Voigt: Genetic programs constructed from layered logic gates in single cells. Nature, 2012, 491, 249–253.