View source for Inkorporacija fotosintetsko aktivnih kloroplastov iz alg v kultivirane celice sesalcev kot pot k fotosintezi pri Živalih

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39477444// Incorporation of photosynthetically active algal chloroplasts in cultured mammalian cells towards photosynthesis in animals]

== Uvod == 
Fotosinteza je proces, pri katerem rastline in drugi organizmi pretvarjajo svetlobno energijo v kemijsko energijo, shranjeno v obliki ogljikovih hidratov. Gre za temelj življenja na Zemlji, saj pri fotosintezi nastaja kisik, ki ga dihajo aerobni organizi. Fotosinteza poteka v kloroplastih, ki so evolucijsko nastali z endosimbiozo med cianobakterijami in evkariontskim gostiteljem. Za razliko od rastlin in alg živali nimajo kloroplastov in ne zmorejo lastne fotosinteze. [1], [2], [3] V sodobni biomedicini se razvija koncept fotosintetskih terapij, kjer bi vnos fotosintetskih komponent v živalsko tkivo izboljšal celično presnovo. V nedavni študiji so z vbrizganjem nanoskopskih tilakoidov (fotosintetskih membran) v degenerativno spremenjene hrustančne celice dosegli dodatno tvorbo energijskih molekul (ATP, NADPH) in s tem spodbudili anabolizem teh celic. [2], [3] To nakazuje, da bi neposreden prenos celih kloroplastov v živalske celice lahko bil učinkovit način za povečanje proizvodnje energije v gostiteljski celici. Doslej so sicer že izvedli več poskusov vnašanja izoliranih kloroplastov v različne ne-fotosintetske celice, vendar v teh primerih ni bilo jasno potrjeno, da kloroplasti v novi celici ostanejo fotosintetsko aktivni. Nova raziskava Ryote Aokija s sodelavci (2024) predstavlja prelomnico na tem področju. Avtorji so uspeli izolirati fotosintetsko aktivne kloroplaste iz alg in jih vključiti v kultivirane sesalske celice, pri čemer so dokazali, da ti vnešeni organeli v živalski celici ohranijo delujoč fotosistem vsaj nekaj dni. [2]

== Eksperimentalni pristop in celični modeli == 
Za svoje poskuse so raziskovalci izbrali primitivno enocelično rdečo algo Cyanidioschyzon merolae (poimenovano tudi “schyzon”). Ta alga živi v skrajnih okoljih (kisli vroči vrelci ~42 °C, pH ~2) in ohranja nekatere lastnosti, podobne zgodnjim fotosintetskim evkariontom. Pomembno je, da ima C. merolae nenavadno velik genom kloroplasta (243 genov) v primerjavi z večino alg (~100 genov). To pomeni, da kloroplasti te alge kodirajo širši nabor lastnih beljakovin in bi lahko bili potencialno sposobni preživeti dlje časa zunaj matične celice. Številne alge prenehajo normalno delovati pri temperaturah okoli 37 °C, ki so optimalne za gojenje sesalskih celic, medtem ko C. merolae ostaja aktivna tudi pri 37 °C. Poleg tega se kloroplasti ne pretvarjajo zlahka v druge oblike plastidov kot odziv na spremembe okolja. Kot gostiteljski model so uporabili kultivirane celice jajčnikov kitajskega hrčka CHO-K1. Raziskovalci so sklepali, da bodo celice CHO verjetno zmožne sprejeti algne kloroplaste in jih vsaj začasno ohraniti, ne da bi takoj propadle. Za preverjanje fotosintetske aktivnosti vnešenih kloroplastov so uporabili napredne metode fluorescenčnega slikanja, zlasti PAM (pulse amplitude modulation) fluorescenčno mikroskopijo, ki omogoča meritve učinkovitosti fotosistema II v živih celicah. [2]

== Izolacija kloroplastov in vnos v celice ==
Kloroplaste so izolirali iz alg v več korakih: alge so najprej izpostavili osmotskemu šoku v hipotonični raztopini, nato homogenizirali suspenzijo v prisotnosti koruznega škroba in izvedli stopnjevano centrifugiranje. Po centrifugiranju se je v epruveti oblikoval temno zelen pas z visoko vsebnostjo kloroplastov, ločen od ostankov celičnih sten in drugega odpada. Kloroplasti so bili pod mikroskopom sferične oblike (približno 2 μm), obdani z dvojnim ovojem in z ohranjenimi plastmi tilakoidnih membran. Rentgenska analiza je pokazala, da je njihova notranja struktura ostala nepoškodovana. Za preverjanje funkcionalnosti so z dvojno-moduliranim fluorometrom izmerili maksimalni kvantni izkoristek fotosistema II (Fv/Fm). Izolirani kloroplasti so imeli povprečno vrednost ~0,32, kar je primerljivo z vrednostjo ~0,39 pri celih algah. Dodatek herbicida DCMU, ki zavira pretok elektronov v fotosistemu II, je povzročil zmanjšanje fluorescenčnega signala, kar potrjuje prisotnost funkcionalne elektronske prenosne verige. Kloroplasti so pri 4 °C ohranili stabilno morfologijo in fotosintetsko aktivnost vsaj 6 dni, kar omogoča nadaljnjo eksperimentalno uporabo. V nadaljevanju so raziskali možnost vnosa izoliranih kloroplastov v sesalske celice. Zasnovali so sokultivacijo, pri kateri so celicam linije CHO-K1 dodali kloroplaste v razmerju približno 1:100. Po 2 dneh inkubacije so celice sprali, da so odstranili proste kloroplaste, in jih analizirali z mikroskopijo. Ugotovili so, da je približno 20 % celic inkorporiralo 1 do 3 kloroplaste, pri čemer so ti oddajali značilno avtofluorescenco klorofila. Kontrolne celice (brez dodanih kloroplastov) takega signala niso kazale. Posebno zanimiva je bila podskupina (~1 %) "kloroplastno bogatih" celic, ki so vsebovale večje število organelov, v nekaterih primerih tudi več kot 40 kloroplastov na posamezno celico. [2]

== Izzivi kompatibilnosti in preživetja kloroplastov ==
Vnos tujih organelov, kot so kloroplasti, v živalske celice spremljajo številne omejitve. Raziskava je pokazala, da kloroplasti po uspešni inkorporaciji v celice CHO-K1 ne ostanejo trajno prisotni. Njihovo število se je s časom zmanjševalo pri čemer je po dveh dneh od konca sokultivacije imela večina celic le še 1–2 kloroplasta, po štirih dneh pa so v številnih celicah kloroplasti povsem izginili. Kot možna vzroka za zmanjšanje števila organelov so navedli avtofagno razgradnjo (prebava znotraj celice) in razredčenje med celičnimi delitvami. Elektronska mikroskopija je pokazala, da so vneseni kloroplasti obdani z membransko strukturo, podobno fagosomu ali avtofosomu, kar nakazuje, da jih celica obravnava kot tujke in jih loči od citosola. Ti vezikli so bili pogosto locirani v bližini jedra, a membrane kloroplastov niso zlivale z jedrno ovojnico. Pomembno je, da so vneseni kloroplasti v začetnem obdobju po vnosu ohranili tudi lasten dedni material. Z uporabo konfokalne mikroskopije in barvanja DNA so raziskovalci potrdili prisotnost krožne kloroplastne DNA v notranjosti organelov, kar pomeni, da so ti vsaj v začetku ostali strukturno in genetsko celoviti. Vendar pa nadaljnje analize kažejo na postopno degradacijo kjer so bili po dveh dneh nekateri kloroplasti deformirani, z razširjenimi prazninami med tilakoidi in plastoglobuli. Po štirih dneh je bila značilna plastovita tilakoidna zgradba v večini kloroplastov že porušena. [2] 

== Dokazovanje funkcionalnosti vnesenih kloroplastov  ==
Ključno vprašanje raziskave je bilo, ali vnešeni kloroplasti dejansko opravljujejo fotosintezo znotraj živalske celice. Avtorji so to preverili z natančnimi fluorescenčnimi meritvami aktivnosti fotosistema II. Po dveh dneh sokultivacije so izbrali CHO-K1 celice, ki so vsebovale kloroplaste, ter izmerili efektivni kvantni izkoristek fotosistema II (oznaka φ_II) v teh kloroplastih. Posamezne celice so obsevali z rdečo svetlobo znane intenzitete in merili delež kvantov svetlobe, ki jih fotosistem II učinkovito pretvori v kemijsko energijo. Izmerjene vrednosti φ_II so nato primerjali z referenčnimi vrednostmi pri izoliranih kloroplastih izven celic. Rezultati so pokazali, da ni bilo statistično značilnih razlik v učinkovitosti fotosistema II med prostimi (izoliranimi) kloroplasti in kloroplasti znotraj celic CHO – vsaj ne v prvih 48 urah po vnosu. Takoj po inkorporaciji in po dveh dneh so vnešeni kloroplasti ohranili približno enak φ_II kot sveže izolirani, neinkorporirani kloroplasti, kar pomeni, da so tudi znotraj živalske celice normalno izvajali primarni fotosintetski proces. To korelira z opažanji, da so bile v tem obdobju njihove tilakoidne membrane še strukturno nepoškodovane. Po štirih dneh pa je φ_II v kloroplastih znotraj celic znatno upadel v primerjavi z izoliranimi kloroplasti. [2]

== Vpliv vnesenih kloroplastov na gostiteljske celice ==
Prisotnost funkcionalnih kloroplastov v živalskih celicah ima lahko neposreden vpliv na njihovo presnovo in rast. V poskusih so opazili, da so se celice CHO-K1, ki so bile v sokultivaciji s kloroplasti, delile hitreje kot kontrolne celice brez kloroplastov. Že po dveh dneh je bila rast pospešena, kar je bilo potrjeno z merjenjem celične koncentracije in statistično značilnimi razlikami. Raziskovalci domnevajo, da kloroplasti prispevajo k presnovi gostitelja preko fotosinteze, saj lahko proizvajajo energijske molekule ali hranila, kot so sladkorji ali ATP, ki pospešujejo celično rast. Ta hipoteza je podprta z opažanjem, da so bili vnešeni kloroplasti pogosto obdani z mitohondriji. Možno je, da mitohondriji prevzemajo produkte fotosinteze kot je kisik in jih vključujejo v lastno presnovo. Pomembno je tudi, da vnos kloroplastov ni povzročil toksičnih učinkov. Nasprotno, celice so bile morfološko normalne, delile so se in tvorile hčerinske celice. To pomeni, da kloroplasti niso zavirali celične delitve, čeprav vsi organeli niso bili enakomerno preneseni na hčerinski celici, kar je tudi razlog zakaj del celic sčasoma izgubi kloroplaste. [2]

== Zaključek ==
Nova študija je uspešno pokazala, da je mogoče vgraditi fotosintetsko aktivne kloroplaste alg v živalske celice in s tem za kratek čas vzpostaviti fotosintetsko aktivnost v tipični ne-fotosintetski celici. Raziskovalci so izolirali intaktne kloroplaste iz alge C. merolae, jih vnesli v celice CHO-K1 in dokazali, da ti organeli vsaj dva dni ohranijo delujoč fotosistem II v gostiteljski celici. V tem obdobju so vnešeni kloroplasti celo koristno vplivali na celico kjer so pospešili njeno rast in se obnašali kot začasni endosimbioti. Po nekaj dneh so kloroplasti sicer začeli propadati, vendar je bil s tem dosežen pomemben dokaz koncepta. Uspeh predstavlja prvi korak k ustvarjanju stabilnih fotosintetskih simbioz v živalskih sistemih. Kaže nam, katere ovire bo potrebno odpraviti in kakšne lastnosti morajo imeti tako organeli kot gostiteljske celice za uspešno dolgoročno simbiozo. V prihodnosti lahko na osnovi teh spoznanj pričakujemo razvoj izboljšanih metod, ki bodo omogočile trajno integracijo kloroplastov v celice živali, s čimer se odpira pot v nove terapije in biotehnološke aplikacije.

== Literatura ==
[1] Chen, P., Liu, X., Gu, C., Zhong, P., Song, N., Li, M., Dai, Z., Fang, X., Liu, Z., Zhang, J., Tang, R., Fan, S., & Lin, X. (2022). A plant-derived natural photosynthetic system for improving cell anabolism. Nature, 612(7940), 546–554. https://doi.org/10.1038/s41586-022-05499-y 

[2] Aoki, R., Inui, Y., Okabe, Y., Sato, M., Takeda-Kamiya, N., Toyooka, K., Sawada, K., Morita, H., Genot, B., Maruyama, S., Tomo, T., Sonoike, K., & Matsunaga, S. (2024). Incorporation of photosynthetically active algal chloroplasts in cultured mammalian cells towards photosynthesis in animals. Proceedings of the Japan Academy. Series B, Physical and Biological Sciences, 100(9), 524–536. https://doi.org/10.2183/pjab.100.035 

[3] Wang, Y., Xue, Y., Zhang, T., Fang, Q., Jin, M., Wang, X., Wang, Z., Hu, Y., Zhao, W., Lou, D., & Tan, W. Q. (2021). Photosynthetic biomaterials: applications of photosynthesis in algae as oxygenerator in biomedical therapies. In Bio-Design and Manufacturing (Vol. 4, Issue 3, pp. 596–611). Springer. https://doi.org/10.1007/s42242-021-00129-4