View source for REPARO

REPARO je projekt, ki ga je leta 2024 pripravila ekipa kitajske Univerze Xiamen. Ekipa je za svoj projekt prejela zlato medaljo in nagrado za najboljši projekt v svoji kategoriji.

= Uvod =

Razlog za hitre podnebne premembe je med drugim tudi obsežno krčenje gozdov, k čemur pomembno prispeva poraba lesa za proizvodnjo papirja. Eden izmed ukrepov za zmanjšanje te porabe je recikliranje odpadnega papirja, vendar pa trenutni postopki recikliranja niso optimalni. Glavni izziv predstavlja odstranjevanje črnila. Ta postopek porabi velike količine vode in topil, zato je dražji, onesnažuje okolje in predstavlja nevarnost za zdravje delavcev v tej industriji. Poleg tega po odstranjevanju črnila v vodi ostane veliko težkih kovin, kar še dodatno onesnažuje okolje.

= CILJ =

Ekipa je s svojim projektom poskušala razviti postopek odstranjevanja črnila z odpadnega papirja, ki bi bil bolj varen in bolj ekonomičen, hkrati pa bolj učinkovit od trenutno uporabljenih metod. Črnilo so poskušali odstraniti s pomočjo encimov, težke kovine v vodi po odstranitvi črnila, pa z adsorpcijo z metalotioneini. Tekom projekta so razvili tudi test, s katerim so lahko preizkusili učinkovitost uporabljenih encimov. Ker gre pri čiščenju odpadne vode za gensko spremenjene organizme, ki adsorbirajo težke kovine, in bi se lahko sprostili v okolje, so dodali še stikalo za uničenje, odzivno na modro svetlobo.

= IZVEDBA =

== 1. Encimsko odstranjevanje črnila ==

Recikliranje papirja se začne s pripravo papirne kaše, ki ji nato dodajo velike količine topil. Ker papir pri postopku zbledi, mešanici dodajo še različna belila, kar še poslabša kakovost končnega izdelka. Po obdelavi s kemikalijami, se črnilo iz mešanice odstrani s postopkom flotacije. Gre za postopek, pri katerem v flotacijsko celico vpihujejo zračne mehurčke, na katere se vežejo delci črnila. Te nato odnese na površino, kjer nastaja pena, ki se odstranjuje. Za večjo čistost se ta postopek ponovi v več zaporednih flotacijskih celicah, kar poveča izgubo vlaken in posledično zmanjša izkoristek. 
Skupina je velike količine topil poskusila nadomestiti z ustreznim encimom. Izbrali so si različne encime, in sicer celulazo EG5C ''Bacillus subtilis'', monooksigenazo CYP199A4 ''Rhodopseudomonas palistris'' in lakazo ''Rheinheimera'' sp. Postopek flotacije so nadomestili z uporabo hidrofobnega topila limonena, da bi izboljšali izkoristek. 
Z odstranjevanjem črnila iz papirja, na katerem je bil natisnjen enak članek, so primerjali učinkovitost kemične metode odstranjevanja, pri kateri so uporabili natrijev hidroksid (NaOH), in odstranjevanje z encimi. Iz papirja so najprej pripravili papirno kašo, ji dodali ustrezna topila ali encime, po inkubaciji pa dodali še limonen. Tekočino so po odstranitvi črnila ločili od papirja, ga posušili, nato pa z računalniškim programom ocenili kakšna je njegova barva. Med encimi je bila najbolj uspešna monooksigenaza, ki sicer ni dosega enake čistosti kot kemična metoda. 
S pomočjo literature so zato izbrali več monooksigenaz. Izbrane so bile monooksigenaze, pri katerih je lahko (namesto NADPH) donor elektronov vodikov peroksid (H2O2), ki je cenejši. Pri odstranjevanju encima so bile ponovno najbolj učinkovite monooksigenaze CYP199A4, zato so za odstranjevanje izbrali eno od mutant tega encima.


== 2. Izločanje rekombinantnega encima ==

Izolacija encima bi podaljšala in podražila celoten postopek, zato so izbrali dva pristopa, s katerimi bi se rekombinantni proteini izločili v okolico: avtolizo celic, ali pa uporabo signalnih peptidov.
Za lizo celic so uporabili sistem FLSA (''ang.'' FhuD-T7-lysozyme-SsrA mediated autolytic system). FhuD je signalni peptid, ki omogoča, da lizocim T7 preide v periplazemski prostor, kjer razgradi peptidoglikan v celični steni, s tem pa povzroči lizo celic. Dodatno protein SsrA omogoča razgradnjo T7 lizocima, v primeru, da bi prišlo do puščanja promotorja. Učinkovitost sistema so preverili tako, da so v bakterijah najprej izrazili sfGFP, nato pa z arabinozo inducirali avtolizo celic. Merili so fluorescenco supernatanta in kulture. Ker je bila učinkovitost tega sistema prenizka, so ga poskušali prilagoditi z mutacijo lizocima T7, menjavo signalnega peptida in menjavo linkerja. 
Predvidevali so, da avtoliza zaradi porabe velikih količin induktorjev ne bi bila najbolj primerna za uporabo v industriji, zato so se raje odločili za uporabo signalnih peptidov. Za primerjavo so uporabili sfGFP z različnimi signalnimi peptidi. Po indukciji izražanja so tako kot pri avtolizi merili, kakšna je bila fluorescenca supernatanta, kulture in kakšna je rast kulture (OD600). Po primerjavi osmih različnih signalnih peptidov, so izbrali signalni peptid LMT, ki je zagotavljal zadostno izločanje in ni povzročil prevelikega bremena za delovanje celic. 
Primerjali so še učinkovitost predhodno izbranih monooksigenaz z izbranim signalnim peptidom, pri tem pa so izbrali encim CYP199A4 z mutacijo T253E.
Z uporabo signalnega peptida so omogočili uporabo supernatanta bakterijske kulture za odstranjevanje črnila, brez postopkov izolacije proteina. Po proizvodnji recikliranega papirja, bi bil ta obdelan z visokimi temperaturami, s čimer bi preprečili kontaminacijo z bakterijami.


== 3. Čiščenje odpadne vode ==

Po odstranjevanju črnila v odpadni vodi ostane velika količina težkih kovin, kot so svinec, krom, kadmij in živo srebro. Skupina je težke kovine v vodi poskusila odstraniti s pomočjo bakterij, ki bi izražale metalotioneine. To so majhni proteini, bogati s cisteinskimi aminokislinskimi ostanki, ki so sposobni vezave težkih kovin. Preizkusili so dve možnosti: izražanje metalotioneinov na površini celic ali pa izražanje metalotioneinov znotraj celic skupaj s transporterji za kovinske ione. 
Za predstavitev metalotioneinov na površini ''E. coli'' BL21 (DE3), so uporabili INPNC sistem. Gre za skrajšano obliko INP (''ang.'' Ice nucleoprotein) bakterije ''Pseudomonas syringae'', ki vsebuje N- in C-končno domeno. Ta omogoča sidranje proteinov na površino bakterije. Za adsorpcijo težkih kovin so uporabili človeška metalotioneina MT3 in MT2A. Tako kot ostali metalotioneini vežeta dvovalentne ione težkih kovin, vendar pa za razliko od preostalih MT2A omogoča tudi adsorpcijo Cr2O72- ionov. Po podatkih iz literature naj bi bila predstavitev na površini bolj uspešna pri adsorpciji kovin, vendar pa je učinkovitost adsorpcije kadmija nizka. Kot rešitev za ta problem so predstavili možnost izražanja metalotioneinov znotraj celic, ki bi sočasno izražale tudi transportni sistem za te ione. Pri tem bi bil uporabljen MntA, ki je odgovoren za transport manganovih in kadmijevih ionov. 

== 4. Stikalo za uničenje ==

Ker bi v postopku čiščenja odpadne vode uporabili gensko spremenjene bakterije, ki bi se lahko sprostile v okolje, so dodali še stikalo za uničenje. Odločili so se za uporabo stikala, odzivnega na modro svetlobo, s tem so se ponovno poskusili izogniti uporabi prevelikih količin induktorjev. Uporabili so sistem LexRO/pColE408, ki bi uravnaval izražanje toksina CcdB. Toksin CcdB tvori kompleks z DNA girazo in s tem prepreči njeno delovanje. Izražanje toksina CcdB v tem vezju uravnava promotor pColE408, ki je sestavljen iz ColE promotorja in LexA(408) operatorja, kamor se veže LexRO. LexRO je represor, ki v temi dimerizira, se veže na pColE408 promotor in s tem prepreči izražanje toksina CcdB. Ko celice osvetlimo s svetlobo točno določene valovne dolžine pa dimer razpade, začne se izražanje CcdB, kar povzroči smrt celice. Ker bi lahko prišlo do celične smrti zaradi puščanja promotorja pColE408, je bil antitoksin CcdA, ki nevtralizira toksin CcdB, pod nadzorom šibkega konstitutivnega promotorja.

= PRIHODNJE USMERITVE =

Velike količine odpadnega papirja nastanejo tudi zaradi napak pri pisanju. Za popravke se pogosto uporabljajo izdelki, s katerimi lahko te napake popravimo, vendar pa imajo ti izdelki določene pomanjkljivosti. To so predvsem učinkovitost in vpliv na okolje, poleg tega puščajo vidne sledi, zaradi česar se listi pogosto zavržejo, kar poveča količine odpadnega papirja. Skupina je zato kot možnost za nadaljnje raziskovanje predstavila izdelek, ki bi omogočal vsakodnevno odstranjevanje črnila. Ker je črnilo sestavljeno iz hidrofobnih pigmentov, so predvidevali, da bi ga lahko z uporabo hidrofobnih topil uspešno odstranili s papirja. Pri tem bi uporabili mikroemulzijo limonena in ramnolipidov, surfaktantov, ki bi omogočali, da se črnilo odstrani iz papirja. Za ponovno uporabo mikroemulzije, pa bi raztopljeno črnilo odstranili z uporabo hitozana, na katerega bi se črnilo adsorbiralo.

= ZAKLJUČEK =

Ekipa kitajske Univerze Xiamen je razvila postopek, s katerim bi lahko bistveno izboljšali odstranjevanje črnila iz odpadnega papirja pri recikliranju. Alternativa velikim količinam topil, ki onesnažujejo okolje in predstavljajo nevarnost za delavce v industriji, je uporaba rekombinantnih encimov, sintetiziranih v ''E. coli'' BL21 (DE3), ki bi se iz celice izločali s pomočjo signalnih peptidov. Po izdelavi papirja, bi bil ta obdelan z visoko temperaturo, s čimer bi preprečili kontaminacijo z bakterijami. Ker pri postopku odstranjevanja nastanejo velike količine odpadne vode, ki je onesnažena s težkimi kovinami, so dodali še stopnjo čiščenja. Za to so uporabili bakterije, ki so izražale metalotionine, na katere bi se težke kovine adsorbirale. Možnost uhajanja bakterij so preprečili z dodatkom stikala za uničenje. 
Na ta način bi ekipa povečala recikliranje odpadnega papirja na bolj ekološki način, zmanjšala uporabo lesa za pridelavo papirja, s tem pa zmanjšala vpliv na podnebne spremembe. 

= VIRI IN LITERATURA =

[1] https://2024.igem.wiki/xmu-china/