View source for Konstruirane bakterije za z bližnjo infrardečo svetlobo inducirano izražanje protirakavih terapevtikov

Izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/s43018-025-00932-3#citeas Engineered bacteria for near-infrared light-inducible expression of cancer therapeutics]

= Uvod =

Rak je že nekaj desetletij eden vodilnih vzrokov umrljivosti v svetu in njegovo globalno breme se iz leta v leto povečuje. Čeprav so konvencionalni načini zdravljenja, kot sta kemoterapija in radioterapija dosegli določen napredek, ostajajo številni izzivi, povezani s toksičnostjo, nizko specifičnostjo in omejeno učinkovitostjo teh pristopov. S porastom sodobnih raziskav se v onkologiji vse bolj uveljavlja koncept uporabe t. i. živih bioterapevtikov, ki se kažejo kot potencialno dopolnilo ali celo alternativa že obstoječim terapijam. Napredki na področju genskega inženirstva omogočajo razvoj bakterijskih sevov, sposobnih selektivne kolonizacije tumorskega mikrookolja – predvsem hipoksičnih in imunosupresivnih regij znotraj tumorjev. Zaradi svoje specifičnosti in afinitete do takšnih okolij, predstavljajo bakterije kot so "Escherichia coli", "Salmonella typhimurium", "Listeria monocytogenes" in "Pseudomonas aeruginosa" obetaven vektor za tovrstne terapevtske pristope. Ne glede na to lahko nenadzorovana ali prekomerna ekspresija terapevtskih proteinov povzroči toksičnost tudi v zdravih tkivih. Zato so bili razviti različni inducibilni sistemi za regulacijo bakterijskega izražanja, ki omogočajo aktivacijo z zunanjimi signali, kot so toplota, svetloba ali kemični induktorji. Posebno zanimanje vzbuja optogenetika, pri kateri se svetlobno občutljivi proteini, izvorno prisotni pri bakterijah in glivah, uporabijo za uravnavanje transkripcije znotraj živih celic.

= =

Čeprav so številni svetlobno inducibilni sistemi pokazali visoko učinkovitost v in vitro pogojih, njihova uporaba v živih organizmih ostaja omejena. Temu je tako zaradi šibke penetracije modre svetlobe skozi tkiva ter možnosti svetlobno povzročene toksičnosti. Zaradi teh omejitev je vse več raziskovalnega zanimanja usmerjenega v bližnjo infrardečo svetlobo (NIR; 650–900 nm), ki se izkazuje za bistveno primernejšo pri in vivo aplikacijah. V odgovor na omejitve obstoječih svetlobno inducibilnih sistemov so v članku "Engineered bacteria for near-infrared light-inducible expression of cancer therapeutics" (Nature Cancer, 2025) razvili nov optogenetski sistem poimenovan NETMAP ("Near-infrared Transcription Modulation via Activated PadC"). Sistem temelji na himeričnem fotoreceptorju PadC, ki ob osvetlitvi z bližnjo infrardečo svetlobo katalizira pretvorbo GTP v c-di-GMP – sekundarni prenašalec, ki aktivira transkripcijski faktor MrkH iz "Klebsiella pneumoniae". Ta se veže na promotor PmrkA in sproži transkripcijo ciljnih genov.
Pri izdelavi sistema NETMAP so najprej primerjali aktivnost dveh različic svetlobno odzivne digvanilat ciklaze PadC (PadC4 in PadC10) v prisotnosti NIR svetlobe (660 nm). PadC4 je izkazal višjo inducibilnost izražanja poročevalskega sistema luxCDABE (~3,7-krat) in je zato bil uporabljen v nadaljnjih poskusih. Optimizacija valovne dolžine svetlobe je pokazala, da 710 nm povzroči najmočnejšo aktivacijo transkripcije brez vpliva na rast bakterij. Z namenom zmanjšanja bazalne aktivnosti sistema so uporabili sev "Salmonella enteritidis" 3934 ΔXII, iz katerega je bilo izbrisanih 12 endogenih digvanilat ciklaznih domen. V primerjavi z izhodiščnim sevom je ΔXII pokazal znatno večjo inducibilnost, vendar pa je bilo preveč tveganja za uporabo v živih organizmih. Za nadaljnjo validacijo in uporabo in vivo je bil uporabljen sev ΔXIV kot terapevtski vektor z minimalno bazalno aktivnostjo in visoko inducibilnostjo. Sev ΔXIV je bil konstruiran iz seva ΔXII z dodatno delecijo gena rpoS, ki kodira transkripcijski regulator za odziv na stres in virulenčne dejavnike, ter gena purI, ključnega za biosintezo purinov. Ti dodatni genetski modifikaciji sta bili namenjeni nadaljnjemu zmanjšanju presnovne aktivnosti bakterij v zdravih tkivih ter izboljšanju varnostnega profila seva.
V nadaljnjih eksperimentih so si znanstveniki prizadevali izboljšati stabilnost izražanja terapevtskih proteinov in zmanjšati potrebo po večkratnih aplikacijah z razvojem novega konstrukta ΔXIVPadC4. V ta namen so v genom ΔXIV vgradili svetlobno odzivna regulatorna gena padC4 in bphO ter terapevtska zapisa za PD-L1nb in CTLA-4nb v enoten plazmid, dodatno stabiliziran s toksin–antitoksin sistemom Hok–Sok. Z uporabo tega izboljšanega sistema so testirali, ali lahko že enkratna intratumorska aplikacija zadostuje za sprožitev učinkovitega protitumorskega odgovora ob vsakodnevni osvetlitvi z NIR svetlobo v obdobju devetih dni. Miši z limfomom, zdravljene s sevom ΔXIVPadC4-NETMAP-PD-L1nb+CTLA-4nb in izpostavljene NIR svetlobi, so pokazale zmanjšano rast tumorja v primerjavi s kontrolnimi skupinami (negativna kontrola s PBS; ΔXIV brez genov in svetlobe; ΔXIV-NETMAP s terapevtskimi geni, a brez svetlobe). Poleg tega so imele te miši stabilno telesno težo skozi celotno trajanje zdravljenja, kar kaže na dobro prenosljivost terapije in nizko toksičnost le-te. 

Da bi ocenili, ali lokalno inducirana proizvodnja nanoteles PD-L1nb in CTLA-4nb preko sistema NETMAP sproži sistemski imunski odziv, so pri miših po enkratni intratumorski aplikaciji ΔXIVPadC4-NETMAPPD-L1nb+CTLA-4nb in vsakodnevni osvetlitvi z NIR svetlobo (710 nm) analizirali različne imunske populacije v tumorjih, vranici in bezgavkah. V primerjavi s preostalimi tremi kontrolnimi skupinami (negativna kontrola s PBS; ΔXIV brez genov in svetlobe; ΔXIV-NETMAP s terapevtskimi geni, a brez svetlobe) so tretirane miši izkazale izrazito povečanje populacije CD8+ T-celic v vseh treh analiziranih tkivih, kar nakazuje okrepljeno aktivacijo celične imunosti. Pomembno je tudi, da je znotraj tumorjev in vranice opaženo statistično značilno zmanjšanje deleža regulatornih T-celic, ki običajno zavirajo imunski odziv. Pripravljen je bil tudi sklop poskusov, usmerjen v oceno ustvarjanja imunskega spomina, kar je ključno za dolgoročno zaščito pred ponovitvijo bolezni. Analiza populacij spominskih T-celic v vranici je pokazala, da so tretirane miši imele povečano število spominskih T-celic. Ti rezultati potrjujejo, da lokalna terapija z ΔXIVPadC4-NETMAP ne le izzove močan primarni odziv, temveč tudi oblikuje imunski spomin, ki lahko zavira rast metastaz ali prepreči ponovitvijo bolezni.

Znanstveniki so nato želeli preveriti, ali se sistem NETMAP lahko prilagodi tudi za tumorje z nizko imunogenostjo, kot je model CT26 raka debelega črevesa. Da bi izboljšali terapevtski izkoristek, so v sistem NETMAP namesto nanoteles vključili dva terapevtska proteina: azurin in ClyA, s čimer so razvili različico NETMAP^(Azurin+ClyA). Azurin, pridobljen iz bakterije "Pseudomonas aeruginosa", je znan po svoji sposobnosti prodiranja v tumorske celice, kjer preko interakcije s tumorsupresorskim proteinom p53 sproži apoptozo. ClyA je bakterijski toksin iz "Escherichia coli", ki povzroča trajno poroznost celičnih membran sesalcev in spodbuja sproščanje proinflamatornega interlevkina-1β (IL-1β). Analiza je pokazala, da je izražanje obeh terapevtskih proteinov odvisno od trajanja osvetlitve z NIR svetlobo. Za in vivo ovrednotenje so miši s tumorsko linijo CT26 razdelili v štiri skupine: G1 (negativna kontrola s PBS), G2 (netransformirani ΔXIVPadC4), G3 (ΔXIVPadC4-NETMAP^(Azurin+ClyA)  brez osvetlitve), in G4 (ΔXIVPadC4-NETMAP^(Azurin+ClyA) z 2-urno NIR osvetlitvijo na dan). Po devetih dneh, se je le pri skupini G4 zmanjšala tumorska rast, poleg tega pa so miši v tej skupini živele dlje kot miši pri ostalih skupinah.

Za ovrednotenje kliničnega potenciala sistema NETMAP je bil razvit personaliziran model ksenografta (PDX) kolorektalnega raka, temelječ na tumorskih vzorcih, pridobljenih neposredno od bolnikov. Po večgeneracijskem gojenju v miših je bilo tumorsko tkivo natančno pripravljeno in subkutano implementirano v imunokompromitirane miši. Sledila je aplikacija terapevtskih sevov: miši so prejele bodisi intratumorsko injekcijo PBS (G1), sev ΔXIVPadC4-NETMAP^(Azurin+ClyA) brez aktivacije (G2) ali isti sev z dnevno osvetlitvijo z NIR svetlobo valovne dolžine 710 nm (G3). Miši iz skupine G3 so bile med prvim devetdnevnim obdobjem vsak dan dve uri izpostavljene NIR svetlobi, kar je vodilo do izjemnega terapevtskega učinka – 30 dni po začetku zdravljenja je bilo pri tej skupini opaženo ~80% zmanjšanje velikosti in mase tumorjev v primerjavi s kontrolami. Za potrditev histoloških učinkov terapije so bile uporabljene fluorescenčne in klasične histološke metode: DAPI je označeval celična jedra, Ki67 proliferacijsko aktivne celice, medtem ko je test TUNEL detektiral apoptozo. V G3 vzorcih je bilo opaženo zmanjšano izražanje Ki67 ter povečana TUNEL signalizacija, kar kaže na zmanjšanje celične rasti in povečano celično smrt. Barvanje s hematoksilin-eozinom je razkrilo morfološke spremembe, značilne za terapevtski odziv – zmanjšanje celične gostote in prisotnost nekroze.

= Zaključek =

Na podlagi rezultatov študije lahko zaključimo, da predstavlja razvoj natančno nadzorovanih in odzivnih terapevtskih sistemov ključen korak k uspešni klinični uporabi optogenetskih pristopov. V tej študiji je bil predstavljen nov, z NIR svetlobo induciran optogenetski sistem NETMAP, ki omogoča prostorsko-časovno regulirano ekspresijo terapevtskih proteinov v za ta namen načrtovani bakterijski kulturi "S. enteritidis". NETMAP omogoča hitro in močno aktivacijo po osvetlitvi ter izkazuje visoko genetsko stabilnost po enkratni intratumorski aplikaciji. Zaradi dobre tkivne penetracije NIR svetlobe lahko terapijo izvajamo neinvazivno, kar bistveno izboljša klinični potencial tega sistema. Razvita sta bila dva terapevtska pristopa, prilagojena imunogenosti tumorjev. Pri imunogenih tumorjih so z uporabo nanoteles proti CTLA-4 in PD-L1 dosegli aktivacijo protivnetnega imunskega odziva, medtem ko so pri manj imunogenih tumorjih s terapevtsko ekspresijo azurina in ClyA inducirali apoptozo tumorskih celic. Posebej pomembna so opažanja iz modela PDX kolorektalnega raka, kjer je že enkratna aplikacija sistema NETMAP povzročila izrazito zmanjšanje tumorske mase in proliferacijske aktivnosti, hkrati pa je bila opažena povečana stopnja apoptoze, kar dodatno potrjuje učinkovitost tega sistema v klinično relevantnih pogojih. Čeprav sistem prikazuje izjemen potencial, ostaja prostor za izboljšave – predvsem v smeri razvoja bolj učinkovitih svetlobno odzivnih komponent in krajšanja časa izpostavljenosti svetlobi. 

= Literatura =
Qiao, L., Niu, L., Wang, Z. "et al". Engineered bacteria for near-infrared light-inducible expression of cancer therapeutics. "Nat Cancer 6", 612–628 (2025). https://doi.org/10.1038/s43018-025-00932-3