View source for KunPeng

[https://2025.igem.wiki/tianjin/index.html KunPeng] je projekt skupine iz Taijina, ki je bil leta 2025 na tekmovanju iGEM nagrajen kot najboljši sestavljeni biološki del podiplomskih študentov. 
==Uvod==
Ljudje se že od nekdaj ščitimo pred mrazom na različne načine. Ščitimo se že zaradi same potrebe po preživetju, kot tudi zaradi želje po večjem udobju. Težave kot so suha, razpokana koža, zamrznjene površine, poškodbe celic zaradi mraza in podobno, so vse pogostejše – tega pa si ne želimo. Vse te težave pa temeljijo na tvorbi ledu in ob tvorbi kristalov ledu pride do poškodb celic in materialov. Kitajska iGEM ekipa se je osredotočila na kožne težave zaradi mraza. Ob tvorbi kristalov ledu v koži pride do poškodb celičnih membran in proteinov. Dejansko trenutno še nimamo učinkovitih rešitev za te probleme. Večina krem za suho kožo deluje na hidraciji, ne preprečijo pa nastanka poškodb zaradi ledenih kristalov in posledično poškodb celic. Zato so v kitajski iGEM ekipi Tianjin razvili nov pristop k zaščiti kože pred mrazom, ki temelji na uporabi antifriz proteinov [1].

===Antifriz proteini===
Antifriz proteini (AFP) so proteini prisotni pri številnih organizmih, ki živijo v polarnih območjih. Ti proteini znižajo ledišče vode oziroma telesnih tekočin. To lahko naredijo preko dveh različnih mehanizmov – AFP se vežejo na robove novo tvorjenih kristalnih jeder voder, kar prepreči njihovo nadaljnjo rast in tako zamrznitev vode. Drugi mehanizem pa je destabilizacija kristalne mreže ledu in s tem preprečitev tvorbe kristalov. AFP spadajo med glikoproteine, proteine brez posttranslacijskih modifikacij ali pa med peptide. Proteine te vrste najdemo pri mikroorganizmih, rastlinah, nevretenčarjih in vretenčarjih, ki živijo v polarnih območjih. AFP imajo več neodvisnih evolucijskih izvorov in so zato tudi strukturno različni med seboj. Prav tako imajo tudi različno močne vplive na znižanje ledišča vode [2]. 

==Izvedba projekta==
Delo iGEM ekipe se  je začelo s pregledom literature in računalniškim pregledom AFP, da so našli AFP z največjim vplivom na ledišče vode. 

Zbrali so 11 filogenetsko različnih AFP, ki so jih uporabljali kot šasije za nadaljnje delo. Zapise za AFP so vstavili v plazmide pET28a in jih izrazili v ''E. coli''. Gen za AFP v ''E. coli'' je reguliran z laktoznim operatorjem. Proteine so nato izolirali in natančno karakterizirali njihovo zmožnost vpliva na ledišče vode. Pokazali so, da ima vseh 11 izraženih proteinov antifriz aktivnost. Želeli so še izboljšati antifriz lastnosti teh proteinov, zato so izvedli točkovno mutagenezo. Mutirane zapise so vstavili v plazmid pET28a in izrazili. Mutante so ponovno testirali - imeli rahlo izboljšane lastnosti, vendar ne znatno, saj je še vedno prišlo do tvorbe ledu pri testiranju. Zaradi dolgotrajnosti procesa mutageneze so se odločili, da ne bodo nadaljevali v tej smeri.

===Izboljšanje lastnosti antifriz proteinov===
Delo so nadaljevali s fuzijo domen različnih AFP. Zapise za fuzijske proteine so vstavili v plazmid pET28a in jih izrazili. Spet so testirali antifriz lastnosti in ugotovili so, da fuzijski proteini nimajo izboljšanih lastnosti glede na naravne proteine, zato so s projektom nadaljevali v drugi smeri – in sicer lotili so se načrtovanja novih proteinov - de novo razvoja proteinov in modelom obratnega zvijanja (angl. inverse folding). Tudi te proteine so izrazili in testirali. Ugotovili so, da imajo nekateri od teh proteinov antifriz lastnosti. Vendar so te antifriz lastnosti nižje kot pri naravnih  AFP, zato so se odločili, da ne bodo nadaljevali s projektom v smer izboljšanja njihovih lastnosti. 
Delo so nadaljevali s štirimi AFP, in sicer tremi naravnimi in enim mutantom, ki je imel dobre rezultate na prejšnjih testiranjih. Sledilo je testiranje potencialne citotoksičnosti proteinov, saj bi te proteine kasneje želeli uporabiti na koži. Testiranje na mišjih fibroblastih je pokazalo, da proteini niso citotoksični. 
Prvotna ideja je bila izražanje AFP v bakterijah, vendar se je načrt spremenil po posvetovanju z industrijo zaradi visoke cene čiščenja proteinov. Odločili so se, da bo njihov končni konstrukt namenjen za predstavitev na površini kvasovk. Še vedno pa so mutirane proteine in nove proteine izražali v ''E. coli'' zaradi enostavnejše izvedbe.

===Predstavitev na površini kvasovk ''Saccharomyces cerevisiae''===

Delo so nadaljevali v kvasovkah ''Saccharomyces cerevisiae''. Izbrali so sev EBY100, ki omogoča predstavitev na površini preko α-aglutinina. Aga1p je lokaliziran na membrani kvasovk, Aga2p pa se transportira iz celice – med njima potem pride do kovalentne povezave. Sev ima v genomu zapis za Aga1p, ne pa za Aga2p. Zapis za Aga2p so vstavili preko plazmida pR-DK. Na ta zapis so na C-konec fuzirali AFP. Zaradi fuzije se je posledično tudi AFP nahajal na površini kvasovk. Izražanje Aga2-AFP je bilo regulirano z galaktoznim operonom.

===Trehaloza===  
Glede na podatke v literaturi in rezultate predhodnih testiranj so ugotovili, da imajo antifriz proteini omejene zmožnosti vpliva na ledišče vode. Odločili so se svoj projekt izboljšati z uvedbo trehaloze [1]. Trehaloza je nereducirajoč disaharid, ki ga sestavljata dve molekuli glukoze. Trehaloza, tako kot AFP, zniža ledišče vode. Dokazano je tudi, da trehaloza ojača delovanje AFP [3]. Zato se je ekipa odločila, da bodo pripravili še konstrukt, ki bo omogočal biosintezno pot trehaloze. Dodaten razlog za uvedbo trehaloze je vezava relativno visoke količine vode. S tem bi v svojem končnem produktu (kremi) dosegli še hidracijo kože.

Dela so se lotili tako, da so najprej kvasovke gojili v stresnih pogojih, kar je povzročilo pojav aneuplodije kromosoma III. Najverjetneje so kromosom III izbrali, saj se na njem nahajajo geni, ki se aktivirajo v stresnih pogojih. Sledilo je sistematična delecija delov kromosoma III in preverjanje, ali še vedno prihaja do sinteze trehaloze. Na koncu so identificirali pet ključnih genov za sintezo tega disaharida. Z uporabo PCR s prekrivajočimi sekvencami so pripravili dva fragmenta z geni dvema oziroma tremi identificiranimi geni. Sledilo je vstavljanje fragmentov v vektor pRS413, kar so izvedli s kloniranjem po Gibsonu. 

Sledila je transformacija kvasovk z dvema vektorjema - pRS413 z geni za sintezo trehaloze in pR-DK z enim izmed štirih AFP, fuziranim na Aga2p. Sledilo je testiranje antifriz lastnosti celičnih suspenzij in določanje deleža živih celic pri temperaturah ledišča. Rezultate so primerjali z rezultati kvasovk, ki sintetizirajo samo AFP, ne pa tudi trehaloze. Izkazalo se je, da imata trehaloza in AFP sinergičen učinek na zaščito celic pred zamrznitvijo. 

===Cre/loxP rekombinacijski sistem===
Predvidevali so, da koekspresija več različnih AFP ojača zaščito kvasovk pred tvorbo ledu pri nizkih temperaturah, zato so pripravili Cre/loxP rekombinacijski sistem, da bi določili optimalno kombinacijo antifriz proteinov. Sistem je sestavljen iz rekombinaze Cre in loxP mest, ki omogočajo mestno specifične preureditve. Na teh mestih lahko pride do delecije, inverzije ali rekombinacije. Zapis za rekombinazo Cre so pomnožili s PCR iz biokocke in ga vstavili v vektor pET28a s kloniranjem po Gibsonu. Izražanje gena je bilo regulirano z lac operonom. 

Pripravili so tudi vektor z loxP mesti za rekombinazo Cre. Iz posameznih biokock so s PCR s prekrivajočimi sekvencami pomnožili fragmente ori, gen za protein araC, gen za protein Rep101 in gen AmpR ter jih sestavili v en vektor. Sledilo je vstavljanje kasete z geni za AFP. Kaseto so pripravili tako, da je bil vsak gen svoja enota, na katero lahko deluje rekombinaza. Vsak gen je imel svoj promotor BAD in svoj T7 terminator. Pred vsakim promotorjem in za vsakim terminatorjem je bilo bilo vstavljeno loxP mesto. Tako je bilo omogočeno neodvisno izražanje genov in rekombinacija vsakega gena posebej. Kaseto so v vektor vstavili preko kloniranja po Gibsonu.
Sledila je kotransformacija kvasovk s plazmidom s Cre in plazmidom s kaseto genov za AFP. Po indukciji je rekombinaza Cre naključno delovala na kaseto antifriz proteinov. Testirali so preživelost transformant pri nizkih temperaturah. Celice z najboljšimi rezultati so bile najbolj odporne na nizke temperature. Optimalno kombinacijo antifriz proteinov so določili s sekvenciranjem celic, ki so se izkazale kot najodpornejše na nizke temperature. Teh rezultatov niso objavili.

===Multipleksni mestno-specifični inverzijski sistem===
Razmerja med koncentracijami AFP imajo lahko velik vpliv na krioprotektivne lastnosti celice. Različne koncentracije proteinov so posledica različnih ravni izražanja posameznih genov. Da bi določili optimalna razmerja med AFP, so multipleksni mestno-specifični inverzijski sistem. Uporabili so plazmid pRS415-GAL1-Rci, ki ima zapis za DNA invertazo Rci. Ta prepozna mesta sfxa101 in obrne segment med dvema takima mestoma. Pripravili so plazmid pTJ25-MI, na katerem so bili različno močni promotorji – močni promotorji (pGMP1, pTDH3, pTEF1), srednje močni promotorji (pPGK1, pPDC1, pTEF2, pTPI1) in šibki promotorji (pCHO1, pADH1, pCYC1). Pred in za vsak promotor vstavili sfxa101 mesta. V ta plazmid so zaporedoma vstavili tudi zapise za AFP, med katerimi so bila sfxa101 mesta. Z obema plazmidoma so izvedli transformacijo. Na plazmidu pTJ25-MI je nato prišlo do številnih inverzij. Posledično so bili različno močni promotorji pred različnimi geni za antifriz proteine. Transformante so testirali, glede na preživetje pri nizkih temperaturah. Transformantam z najboljšimi rezultati so sekvencirali genome in tako določili najboljše kombinacije promotorjev in genov za antifriz proteine. Teh rezultatov niso objavili.


==Zaključek==
Skupina je razvila sistem za ekspresijo AFP in trehaloze, ki zniža ledišče vode in omogoča preživetje celic pri temperaturah pod lediščem vode. Sistem so razvili tako, da so izražali najbolj učinkovite antifriz proteine v razmerjih, ki dajo optimalne rezultate. Aplikativni cilj projekta je bil razviti kremo za kožo, ki bo kožo ščitila pred poškodbami zaradi nizkih temperatur. Poleg kreme so pa v skupini želeli prav tako razviti tudi premaz za kljuke za avtomobile, da pri nizkih temperaturah ne bi zamrznile, in tudi premaz za usnje, ki bi ga ščitilo pred posledicami nizkih temperatur [1]. 

==Viri==
[1] Tianjin. KunPeng (https://2025.igem.wiki/tianjin/index.html). Pridobljeno 15.4.2026

[2] Eskandari, A., Leow, T. C., Rahman, M. B. A., & Oslan, S. N. (2020). Antifreeze Proteins and Their Practical Utilization in Industry, Medicine, and Agriculture. Biomolecules, 10(12), 1649. https://doi.org/10.3390/biom10121649 

[3] Wen, X., Wang, S., Duman, J. G., Arifin, J. F., Juwita, V., Goddard, W. A., Rios, A., Liu, F., Kim, S., Abrol, R., DeVries, A. L., & Henling, L. M. (2016). Antifreeze proteins govern the precipitation of trehalose in a freezing-avoiding insect at low temperature. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 113(24), 6683–6688. https://doi.org/10.1073/pnas.1601519113