View source for Kombiniranje tehnologije induciranih pluripotentnih matičnih celic in genskih modifikacij pri zdravljenju mišične distrofije

=Mišična distrofija=
Prvi opisi bolezni segajo v leto 1836, ko sta pojemanje mišične moči opisala Conte in Gioja, vendar sta simptome pripisala tuberkulozi. Gensko pogojenost pa je leta 1852 predvidel Meryon, ki je predpostavil, da se bolezen gensko prenaša preko mame in prizadene predvsem moške potomce. 
Duchennova mišična distrofija je poimenovana po Guillaume Duchennu, francoskem nevrologu, ki je podrobno opisal tovrstno mišično bolezen. 
Duchennova mišična distrofija prizadene kortikospinalni sistem, natančneje sprednje rogove aferentnih nevronov. Posledica je denevracija mišič oziroma oslabljen sistem motoričnih ploščič. Za bolezen je značilna progresivnost, s predela dlani preko udov in kasneje celotnega telesa. V povprečju so za bolezen dovzetnejši moški, od katerih jih je 5-10% bolezen delovalo avtosomno dominantno. Zdravljenje je simptomatično; kombinacija fizioterapije in antiholinergikov.

==Molekularne osnove Duchennove mišične distrofije (DMD)==
Razlog, da bolezen v večini prizadene moške je v tem, da je vezana na X kromosom. Incidenca bolezni je ocenjena na 1/3.500 moških (Engel in Banker 1986). Prizadet gen za protein distrofin ima v povprečju 65 eksonov in okoli 2000 kb (Koenig et al. 1987; van Ommen et al. 1987; Burmeister et al. 1988). 
Pravilno zvit protein je velik 427 kDa in ima štiri domene; N-terminalna domeno, paličasto domeno, s cisteinom bogato  domeno in C-terminalno domeno (Koenig et al. 1988). Najdemo ga v sarkolemi skeletnih mišic ter na stikih med mišičnimi vlakni in tetivami. Njegova glavna naloge je stabilizacija sarkoleme preko vezave aktina. Prav tako pa so heliksi paličaste domene fleksibilni in elastični kar še dodatno ščiti miofibrile pred mehanskim stresom. Poleg omenjenih funkcij, sodeluje še pri vzpostavitvi stika med sarkolemo in citoskeletom (Rybakova et. al 2000). Glede na posledice  ob njegovi odsotnosti, predvidevajo, da ima vlogo tudi v medcelični signalizaciji. Pravilno lahko deluje le v kompleksu s t.i. »Z distrofinom povezanim proteinskim kompleksom« (Davies & Nowak 2006). 
Najpogostejši defekt gena je intragenska delecija (Forrest et al. 1987; Koenig et al. 1987), kar privede do vezave eksonov, ki onemogočajo translacijo na bralnem okvirju. Takšno hipotezo podpira Westrn blot analiza distrofina, ki je nezaznaven pri pacientih z DMD. Podana je bila tudi hipoteza, da do delecije pride že v prvih desetih eksonih (Malhotra et al. 1988). Koenig et al. (1989) so analizirali delecije na večini gena in določili njihove posledice na mRNA ter bralni okvir. Posledice delecije na bralnem okvirju so analizirali preko intron-ekson meje, med tistima dvema eksonoma, ki sta bila ob boku delecije. Določene so bile tri meje glede na njihov položaj v kodirajočem tripletu. Dve od mej sta vodili do delecije, medtem ko je ena ohranila bralni okvir. Ugotovili so, da lahko 92% delecij pojasnijo kot delecije na bralnem okvirju, le 5 delecij pa se je zgodilo že pred vzpostavitvijo bralnega okvira. Takšna oblika delecije je namreč bolj značilna za druge oblike mišične distrofije.  Pri DMD tako v povprečju pričakujemo alteracije na regiji bogati s cisteinom ter na C terminalni domeni, ki vodijo v hujše oblike mišične distrofije.

=Napredki na področju zdravljenja DMD=
Strategije za zdravljenje DMD lahko razdelimo v štiri kategorije: celična terapija, terapija z zamenjavo genov, supresija nezrelih terminacijskih kodonov in "Preskakovanje eksonov" oziroma v angleščini ''exon skipping'' 

V seminarski nalogi se bom usmerila na celično terapijo, vse ostale oblike terapij pa so podrobno opisane v viru 1. 

Na področju celične terapije je seveda poudarek na uporabi matičnih celic ali pluripotentnih mišičnih celic. Do sedaj je največ uspeha prinesla transplantacija mioblastov v prizadeto (distrofično) tkivo. Mioblasti so se sposobni diferencirati miofibrile, ki so nujne za pravilno delovanje skeletne mišice. Rezultate te transplantacije označujemo za fenomen imenovan »gensko dopolnjevanje«, kar pomeni ekspresijo eksogenih in gostiteljskih genov v mišičnem sinciciju (Watt et al. 1982). Raziskave so nadaljevali na gensko modificiranih mdx miših in zavoljo odličnih rezultatov poizkusili še na ljudeh, vendar je bil izkoristek, žal, prenizek (Mendell et  al. 1995). Raziskave na področju transplantacije mioblastov so bile zelo plodne tudi na višjih sesalcih in trenutni trend je raziskovanje optimalnega imunosupresanta, izboljšanje migracije mioblastov ter izračuna optimalnega števila transplantiranih celic.  Največja ovira celične terapije je insercija celic, saj se (trenutno) injicirajo le intramuskularno (Partridge, 1991) in ne intravenozno kakor bi bilo zaželeno. Intamuskularno injiciranje otežuje terapijo ne le zaradi nedosegljivosti določenih mišic (npr. difragma), temveč tudi zaradi omejitve diferenciacije mioblastov na posamezna področja v mišici. Do leta 2011 sta bili prijavljeni dve klinični raziskavi na tem področju (Torrente et al. in Guilio Cossu).

==Kombinacija genetike in pluripotentnih (iPS) celic==

Leta 2012 so na Univerzi Minessota raziskovalci (Filareto et. al) naredili velik premik na področju zdravljenja Duchennove mišične distrofije. Z uporabo transpozona Sleeping Beauty so popravili fenotip induciranih pluripotentnih distrofičnih celic, jih diferencirali v skeletno-mišične predniške celice in jih transplantirali nazaj v distrofične miši. Presajene celice so imele biokemijsko obnovljen sistem utrofin-distrofin in izboljšano kontraktilno moč. Celice so se pravilno odzivale na poškodbe in opaziti je bilo razvoj nevro-muskularnih sinaps. Raziskovalci so ubrali avtologen pristop k zdravljenju; ex vivo gensko korekcijo pluripotentnih distrofičnih celic pred transplantacijo. Kar je naprednega pri raziskavi je način manipulacije iPS celic preko indukcije Pax7 ali Pax3 v le-teh. Tovrstno metodo so tudi sami razvili. iPS celice so pripravili z retrovirusno transdukcijo TTF celic. Njihovo pluripotentnost so preverili z imunofluorescenčnim barvanjem ter zmožnostjo celic tvoriti embrionalni mezoderm in vivo. Izbrane celice so imele tipičen kariotip in so bile zmožne tvorbe teratom.

===Popravljenje distrofičnih iPS celic===
Za razliko od večine raziskav Duchennove mišične distrofije so raziskovalci uporabili utrofin-distrofin dKO miši in ne mdx miši, saj fenotip bolezni toliko hujši;  hitrejše napredovanje bolezni, abnormalno dihanje, kardiomiopatija in prezgodnja smrt. Takšen fenotip je primerljiv s človeškim. 
Za obnovitev »Z distrofinom povezanega proteinskega kompleksa« so re-ekspresirali µUTRN transgen za katerega je znano, da izboljšuje distrofičen fenotip (nadomešča kompleks utrofin-distrofin) in kot takšen ne izzove imunskega odgovora. Gen so v iPS celice prenesli s Sleeping Beauty sistemom transpozonov, saj omogočajo stabilno ekspresijo v človeških in mišjih celicah. Popravljene iPS celice z µUTRN transgenom so ohranile normalen kariotip.

===Diferenciacija iPS celic v  miogene predniške celice===
Da so zagotovili čim boljšo diferenciacijo so v popravljeni celice in tudi v kontrolnih celicah nadzorovano inducirali ekspresijo Pax3, ki izboljšuje rast miogenih predniških celic. Tiste celice, ki so zadostovale določenim parametrom so izpostavili še osnovnemu rastnemu faktorju za fibroblaste ter doksiciklinu. Po dodatku slednjih so se predniške celice začele proliferirati in po in vitro inducirani diferenciacijii so celice vstopile v zadnjo fazo zorenja iz katerih so se razvile več jedrne celice s stabilno ekspresijo µUTRN, kar potrjujejo izvedena imunofluorescenčna mikroskopija, PCR in western blot analiza.

===Regenerativne lastnosti miogenih predniških celic===
Pridobljene celice so seveda morali preizkusiti in vivo, zato so jih vsadili v tri tedne stare dKO miši, v mišico okoli piščali (Tibialis anterior). Po naslednjih treh tednih so izrezali mišico in jo pripravili na analizo, ki je pokazala prisotnost utrofina. In ne samo to, utrofin je bil zmožen obnovitve sistema proteinov, ki so načeloma povezani le z distrofinom. Prav tako ni bilo zaznati prisotnosti tumorjev, saj so predhodno izločili celice, ki so kazale znake za razvoj le-teh. 
Regenerativne lastnosti so preverili tudi preko fizioterapevtskih testov, ki so dali naslednje rezultate:
Povečana izometrična tetanična sila mišice, povečana absolutna in specifična sila mišica v primerjavi z distrofično mišico, Ni bilo vidnega izboljšanja na področju utrujenosti mišice; še vedno se utrudi enako hitro ali pa le zanemarljivo malo počasneje kot distrofična mišica.
Še vedno pa niso rešili problema intravenoznega injiciranja, ki je dal mešane rezultate. Kljub temu, miogenih celic niso opazili v drugih tkivih; v srčnem in pljučnem tkivu.

=In v prihodnosti ...=
Oblik mišične distrofij je veliko, vendar jih druži skupna lastnost; izguba oziroma nedelovanje distrofina. V primeru, da tega z gensko terapijo ne gre nadomestiti, lahko uporabimo utrofin, kot v primeru Filareto et. al (2013), saj deluje dovolj podobno, da fenotip omili do te mere, da življenje z njim ni več oteženo. Pluripotentne celice na tem področju omogočajo novo obliko terapije, ki ni samo celična, temveč tudi genska, saj jih je lažje manipulirati kot zdrave že diferencirane celice donorske celice. Zagotovo se odpirajo nove možnosti za zdravljenje ne samo mišične distrofije temveč tudi ostalih nevrodegenerativnih bolezni.

=Viri=
1. Fairclough et al. Progress in therapy for Duchenne Muscular Dystrophy. Experimental Physiology, 2011, letn. 96.11, str. 1101-1113.

2. Nakamura et al. Mammalian model od Duchenne Muscular Dystrophy: Pathological Charateristics and Therapeutic Applications.Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2010, volume 2011.

3. Koenig et al. The Molecular Basis for Duchenne versus Becker Muscular Dystrophy: Correlation of Severity with type of Deletion. The American Journal of Human Genetics, 1989, letn. 45, str. 498-506.

4. Filareto et al. An ex vivo gene therapy approach to treat muscular dystrophy using inducible pluripotent stem cells. Nature Communications, 2013, version 4:1549.

5. http://www.muscular-dystrophy.org/ [27. 5. 2013]