View source for Proizvodnja fuzijskega proteina iz domene 3 zunajceličnega proteina virusa denge in liganda M-celic v transgenem rižu kali

== '''Uvod''' ==


Virus denge je RNA virus in spada med flaviviruse . Na ljudi se prenaša s pomočjo več vrst komarjev iz rodu Aedes in sicer predvsem A. aegypti. Obstajajo štirje serotipi virusa denge (DEN 1-4). Virusni  genom je sestavljen iz 11000 bp, ki kodira tri strukturne proteine (protein kapside C, membranski protein prM in ovojnični protein E), sedem ne strukturnih proteinov (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b in NS5) ter kratki nekodirajoči regiji na 5' in 3' koncu. 
Protein E je pomemben ovojnični protein s pomočjo katerega se virus pritrdi na gostiteljevo celico.  Za razvoj cepiva je protein E primerna tarča, saj vsebuje domeno III (EDIII), ki ima ključno vlogo pri vezavi na gostiteljsko celico. Zaradi več serotipov virusa denge je velik problem razviti cepivo, saj infekcija samo z enim serotipom lahko vodi do celega spektra simptomov denge(vročina, denga hemoragična mrzlica ali šok sindrom denge po zaporednih okužbah). Zato so tetravalentne vrste cepiv narejena tako, da so zmožne zagotoviti zaščito proti vsem serotipom brez reaktivacije samega virusa. Za razvoj cepiva so naredili konsenzno zaporedje z primerjavo aminokislinske sekvence EDIII različnih izolatov vseh štirih serotipov. Miške so nato imunizirali z rekombinantno konsenzno domeno III (cEDIII), te pa so razvile nevtralizirana protitelesa proti vsem štirim serotipom virusa denge.
Sistem proizvodnje s pomočjo rastlin nam nudi varno,poceni in oralno cepivo. Vendar je pri oralenem privzemu  cepiva lahko problem, zaradi nizke proizvodnje antigenov povezanih in  s tem povezanim nizkim imunskim odzivom. En način zvišanja imunskega odziva v mukozalnem imunskem sistemu je fuzija antigenskih proteinov z ligandi, ki imajo možnost da prenesejo fuzijski proteinski antigen v mukozalni imunski sistem za povečanje antigenskega privzema v mukozalne imunske celice. Eden od teh ligandov je M celično tarčni peptidni ligand Co1. Ta je pri oralni vakcinaciji miškah povečal privzem fuzijskega antigena v efektivno mesto mukozalnega imunskega sistema in imunskega odziva proti fuzijskem antigenu v primerjavi z samim antigenom.  V tej študiji so naredili fuzijo med peptidnim ligandom Co1 in konsenznim genom domene III virusnega proteina E (scEDIII), da bi povečali  mukozalni imunski odziv. 

'''cDEIII- Co1'''

cDEIII- Co1 fuzijski protein je bil pod kontrolo riževo amilazega 3D promotorja (močen inducibilen promotor) v pogojih sladkornega stradanja v riževem ekspresijskem sistemu. Biološka funkcija fuzijskega proteina pa je bila gledana v mišjem modelu.

'''NAČRTOVANJE EKSPRESIJSKIH RASTLINSKIH VEKTORJEV IN GENOMSKA PCR AMPLIFIKACIJA:'''
Najprej so naredili konstrukt oz fuzijo obeh genov v pMY657. Sledila je amplifikacija z specifičnimi oligonukleotidi. PCR produkt so nato klonirali v pGEM-T Easy vektor, sekvenco pa potrdili z analizo DNA sekvence. Nato so potrjeno DNA sekvenco klonirali na ista mesta v nov vektor pMYV685, ki ima promotor za signalni peptid in 3'UTR regijo rižno amilaznega gena 3D. Transformacijo v riž kali so opravili z bombandiranjem z vektorjem pMYV685. Po transformaciji vektorjev v riž so naredil selekcijo transgenih rižev s pomočjo higromicina (antibiotik).  10 vzorcev transgenega  riža kali z fuzijskim genom smo dobili 2-4 tedne po transformaciji.  Fuzijski gen ustreza velikosti  400 bp. Tega so opazili le pri transgenih rižih in ne pri ne transgenih. 

'''NORTHERN BLOT:'''
Izolirali so totalno RNA iz ne transgenih in transgenih rižev kali 5 dni po indukciji, ki so jo kontrolirali s sladkornim stradanjem. Pri 8/10 je prišlo do pozitivnih signalov za fuzijski protein pri transgenih rižih. 

'''WESTERN BLOT IN KVANTIFIKACIJA LIGANDA FUZIJSKEGA PROTEINA:''' 
Transgenega in ne transgenga riža so analizirali za detekcijo fuzijskega proteina.  Linije transgenega riža, ki so kazale na visoko ekspresijo fuzijskega proteina so nato aplicirali v suspenzijsko kulturo. Za western blot  so analizirali 6 transgenih rižev, ki so imeli najmočnejše signale pri northern blotu. Fuzijski protein je bil najden kot 3 lise na gelu pri 17kDA z anti-denge virusnimi protitelesi. Kvantificirali so fuzijske proteine št. 5,6 in 9 kažejo visoko ekspresijo fuzijskega proteina pri western blotu. Te so nato vzpostavili pogojem sladkornega stradanja in jih nato kvantificirali z ELISO. Največ proteina je proizvajal transgeni riž št. 6 ki je bil nato izbran za selekcijo in vitro in in vivo z privzemom antigena.

'''TEST IN VITRO IN IN VIVO PRIVZEMA ANTIGENA:'''
Za in vitro so uporabljali črevesno zanko, ki vsebuje agregatne limfoidne nodule (Peyers Patches) iz moške BALB/C miške. Proteinske ekstrakte iz ne transgenega riža in transgenega riža, ki so ekspresirali cEDIII ali cEDIII-Co1 fuzijski protein so dodali nodulom in zraven še protitelesa z fluorescentnimi označevalci.
Za opazovanje in vivo antigenskega privzema so opazovali  tako da so tem miškam dali proteinske ekstrakte ne transgenega riža in transgenega riža z fuzijskim proteinom. Nato so jih žrtvovali in spirali nato dodali protitelesa z fluorescentnim označevalcem in nato opazovali dalje.


=='''Zaključek'''==

 
Uporaba ligandov se je izkazala za dobro metodo, ki povzroči prenos fuzijskega proteina v mukozalni imunski sistem za izboljšanje antigenskega privzema in antigenske predstavitve na antigen predstavljajočimi celicami.  Tu smo potrdili vezavo cDEIII-Co1 fuzijskega proteina na Preyers Patches s testom M-celične vezave pri miših.

'''VIR:''' T.G. Kim, M.Y. Kim, N.X. Huy, S.H. Kim, M.S. Yang (2013). M-Cell targeting ligand and consensus dengue virus envelope protein domain III fusion protein production ans transgenic rice calli. ''Mol. Biotechnol'', 54, 880-887.