View source for 48C Cadmium catcher LBP

Švicarska ekipa EPFL je leta 2023 na iGEM tekmovanju s projektom 48C Cadmium catcher LBP osvojila zlato medaljo ter glavno nagrado za najboljše izobraževanje. Njihov projekt je dostopen na povezavi: https://2023.igem.wiki/epfl/home

Avtor povzetka: Maja Deutsch

==Uvod==
Kadmij, 48. element periodnega sistema, je ena izmed težkih kovin, ki najbolj škodujejo zdravju ljudi. Nevarnost kadmija je v zadnjem desetletju privedla do uvedbe ukrepov, ki omejujejo njegovo uporabo v Evropi. Kljub temu je kadmij še vedno prisoten v okolju in različnih izdelkih, kot so cigaretni dim, akumulatorji, pigmenti, premazi, plastika in elektronski deli. Nepravilno odlaganje teh izdelkov, skupaj z rudarjenjem kovin, kjer je kadmij stranski proizvod, in uporabo gnojil, ki vsebujejo kadmij, je povzročilo onesnaženje tal in vode. To pa je vplivalo na naše zaloge hrane in povzročilo zaskrbljujoče razmere, saj je kadmij toksičen za ljudi in vpliva na številne organske sisteme kot so urinarni trakt, respiratorni sistem, centralno in periferno živčevje ter številne druge [1][2].

==Cilj projekta==
Predlagana rešitev je bila razviti živ bioterapevtski izdelek (ang. Live Biotherapeutic Product, LBP), katerega cilj je zmanjšati rakotvorno in toksično kopičenje kadmija v človeškem telesu. Glavni cilj je bil ustvariti modificirane bakterije, ki se lahko začasno pritrdijo na sluznico človeškega tankega črevesa in zadržijo kadmij. Medtem ko so te modificirane bakterije vezane na mukozo preko enega proteina pa preko drugega vežejo kadmij, ki gre skozi prebavni sistem, in tako učinkovito preprečijo njegovo absorpcijo v telo. Nato se bakterije skupaj s kadmijem naravno izločijo iz telesa. Za preprečevanje širjenja v okolju in genske izmenjave z drugimi organizmi bi bile te bakterije avksotrofne (nimajo sposobnosti sintetizirat določenih aminokislin, ki so potrebne za njihovo rast) in bi imele genske mutacije, ki preprečujejo horizontalni prenos genov [1].

==Sestavljanje konstruktov==
===EC20===
Za vezavo in lovljenje kadmija je bil izbran protein EC20, ki je imel najvišjo afiniteto do kadmija, prav tako pa je imel nižjo afiniteto do drugih dvovalentih ionov napram kadmiju. Predvidena struktura EC20 je protein v obliki lasnične zanke, ki ga utrjuje 9 disulfidnih vezi. Sestavljen je iz 41 aminokislin (iz 20 ponovitev glutaminske kisline in cisteina ter končnega glicina). Da bi EC20 dosegel svojo vlogo lovilca kadmija, mora biti izpostavljen lumnu črevesja, kjer bi lahko zajel in nase vezal kadmijeve ione. Ta zahteva je bila izpolnjena tako, da so EC20 povezali s proteinom Lpp-OmpA, ki se prikazuje na površini. Živi bioterapevtski izdelek bi moral prav tako biti sposoben loviti kadmij dokler le-ta ostaja v črevesju, zato bi se moral izražati konstitutivno. To je bilo izpolnjeno tako, da je bil fuzijski protein Lpp-OmpA-EC20 postavljen pod nadzor konstitutivnega promotorja E.coli BBa_J23100. Da bi lahko opravili primerne teste, glede izražanja EC20, je bila na njegov N-konec dodana oznako 6xHis tag, kar je omogočilo način testiranja izražanja proteina s prenosom western, saj ta oznaka omogoča specifično iskanje našega fuzijskega proteina z ustreznim protitelesom. Inženirski konstrukt je bil kloniran v vektor pET-3a, ki je vseboval gen za odpornost proti ampicilinu. Ta plazmid je bil nato transformiran v kompetentni laboratorijski sev E. Coli BL21 DE3 [1].

===SpaC===
SpaC je podenota pilusa SpaCBA. Njegova naravna funkcija je vezava človeške mukoze in kolagena. SpaC je sestavljen iz petih domen, ki so organizirane v območje stebla in vezavno območje. Območje stebla je sestavljeno iz treh domen: D3, D4 in D5. Vezavno območje pa je sestavljeno iz dveh domen: D1 in D2, pri čemer je bolj zunanja vezavna domena D2 tista, ki je v interakciji z mukozo [3].
SpaC mora biti na površini bakterije, da bi lahko opravljal svojo vlogo vezanja na mukozo, zato je bil tako kot EC20 SpaC povezan z Lpp-OmpA. Vezava SpaC v črevesju mora biti le začasna, da se lahko živi bioterapevtski izdelki izločijo in tako odstranijo vezani kadmij. Zahvaljujoč sistemu za nadzor izražanja, ki ga sestavlja operator Lac, inducibilen z IPTG, in je povezan s teofilinskim RNA-stikalon, se je SpaC sintetiziral le, ko so se živi bioterapevtski izdelki gojili v laboratoriju. S sistemom operaterja Lac inducibilnega z IPTG namreč lahko nadzorujemo transkripcijo (v odsotnosti IPTG inhibitor blokira vezavo RNA polimeraze na genski promotor in zavira transkripcijo gena), medtem ko s teofilinskim RNA-stikalom translacijo (ob odsotnosti teofilina stikalo zasede vezavno mesto za ribosom).  Da se je lahko preverilo, ali se SpaC res izraža, je bila na N-konec proteina dodana oznaka Flag. Da pa se je lahko preverilo, ali se protein nahaja na površini, je bilo na njegov C-konec dodano nanotelo, ki veže GFP za vizualno potrditev izražanja na površini. Namesto GFP-ja, ki ima veliko molekulsko maso (27 kDa), je bilo raje uporabljeno nanotelo, ki veže GFP in ima majhno molekulsko maso, le 12,5 kDa [1].

Izkazalo se je, da je velikost SpaC ovirala izvoz na površino. Zaradi tega sta bili oblikovani dve krajši različici fuzijskega proteina SpaC: eno z domenama D1 in D2 ter eno samo z domeno D2. Rezultat teh novih modelov je bilo zmanjšanje proteina za 41,03 kDa in 63,35 kDa. Za skrajšanje prvotnega plazmida sta bili uporabljeni dve različni tehniki kloniranja. Metoda KLD je bila primerna za ohranitev konstrukta z D1 in D2. Ker pa je zaporedje domene D2 vstavljeno med dva dela zaporedja D1, je bil potreben drug pristop z več fazami, ki se je končal s kloniranjem Hifi. Ti metodi sta omogočili odstranitev segmentov zaporedja SpaC, ki niso bili potrebni za vezavo mukoze. Skrajšani plazmidi so bili nato transformirani v kompetentni laboratorijski sev E. Coli BL21 DE3 [1][4][5].

==Varnost (horizontalni prenos genov)==
Horizontalni prenos genov, včasih imenovan tudi lateralni prenos genov, je proces, pri katerem se genski material prenaša med različnimi genomi ali organizmi. Ta prenos DNA lahko poteka med različnimi vrstami, vključno z izmenjavo med prokarionti in evkarionti. Prav tako lahko poteka med tremi organeli, ki vsebujejo DNA, v evkariontskih celicah: jedrom, mitohondrijem in kloroplastom. Horizontalni prenos genov je mehanizem, s katerim lahko organizmi pridobijo nove genetske informacije iz drugih virov, ne le od svojih neposrednih prednikov. Ta proces bi lahko predstavljal težavo za LBP, saj bi lahko interagiral s preostalo črevesno floro. Plazmidi Spac ali EC20 bi se namreč lahko prenesli na druge bakterije v črevesnem okolju, s čimer bi tem celicam podelili nove funkcionalnosti.

Vendar pa so bakterije sposobne izločiti DNA, bogato z uracilom, ne glede na to, ali je njihova lastna ali iz donorske bakterije. Identificirana sta bila dva ključna gena: DUT, ki je odgovoren za zamenjavo uracila s timinom in UNG, gen za uracil N-glikozilazo, ki odstranjuje uracile iz deoksiriboze. To pomeni, da bi moral dvojni izpad teh genov povzročiti nasprotne učinke: znatno vključevanje uracila in izgubo obrambe pred uracilirano DNA bodisi iz celice bodisi iz zunanjih virov. Za to delo je bil uporabljen edinstven sev E. coli, CJ236, ki je bil v osemdesetih letih prejšnjega stoletja prvotno uporabljen za mutagenezo po Kunklu, tehniko za vstavljanje enotočkovnih mutacij v plazmid in je omogočal ustvarjanje uracilnega plazmida iz CJ236.

S celicami CJ236 so izvedli transformacijo s plazmidom enostavnim za manipulacijo, ki kodira GFP, ko je le-ta induciran z arabinozo (pGLO). Bistvena zaporedja uraciliranega plazmida pGLO so:
*GFP - zaporedje, ki kodira zeleni fluorescenčni protein (GFP)
*bla - gen, ki kodira β-laktamazo, encim, ki razgrajuje antibiotik ampicilin
*promotor pBAD - veže AraC-arabinozo in spodbuja vezavo polimeraze RNA ter prepisovanje gena GFP
*araC - gen, ki kodira regulatorni protein, ki se veže na promotor pBAD; sinteza GFP se vključi šele, ko se arabinoza veže na protein AraC
*multiplo klonirano mesto (MCS)

Transformacija pGLO v CJ236 je zaradi dveh mutacij seva povzročila postopno vključevanje uracila v plazmid. Sledila je liza celice za pridobitev uracilnega pGLO. Na koncu postopka pa je bila izvedena transformacijo na sevu CJ236 in kontrolnem sevu. Pri sevu CJ236 se plazmid ni razgradil, ker je bil gen UNG mutiran, pri drugem sevu pa se je plazmid razgradil [1].

==Zaključki in cilji za prihodnost==
Uspešno je bilo dokazano, da lahko LBP zajame kadmij, se pritrdi na mukozo in da se razgradi z naravnimi procesi. Vendar pa na poti do končnega izdelka še vedno obstajajo nerešena vprašanja, ki jih je treba dodatno preučiti in ovrednotiti, saj so vsi do zdaj opravljeni testi ocenjevali funkcionalnost posameznih delov. Po izvedbi določenih poskusov bi se lahko začelo sestavljanje sestavnih delov. Sestavljanje vseh delov v enem sistemu bi pomenilo vključitev konstrukta EC20, konstrukta D1D2 ter mutacij genov DUT in UNG v genom šasije, kar bi preprečilo izgubo plazmida in zmanjšalo tveganje prenosa DNA na druge bakterije. Da bi preprečili širjenje gensko spremenjenih organizmov v okolje ali bolnikovo črevesje, bi bil sev zasnovan kot avksotrofen. Končni inženirsko oblikovani živi bioterapevtski izdelek bi se nato dajal v obliki liofiliziranega izdelka. 

==Viri in literatura==
[1]	EPFL iGEM 2023 - 48C https://2023.igem.wiki/epfl/home (pridobljeno 20. apr. 2024).

[2]	M. Rafati Rahimzadeh, M. Rafati Rahimzadeh, S. Kazemi, A. Moghadamnia: Cadmium toxicity and treatment: An update. Caspian J Intern Med 2017, 8, 135–145.

[3]	A. K. Megta, S. Pratap, A. Kant, A. Palva, I. von Ossowski, V. Krishnan: Crystal structure of the atypically adhesive SpaB basal pilus subunit: Mechanistic insights about its incorporation in lactobacillar SpaCBA pili. Current Research in Structural Biology 2020, 2, 229–238.

[4]	KLD Enzyme Mix | NEB https://www.neb.com/en/products/m0554-kld-enzyme-mix (pridobljeno 20. apr. 2024).

[5]	NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning Kit | NEB https://www.neb.com/en/products/e5520-nebuilder-hifi-dna-assembly-cloning-kit (pridobljeno 20. apr. 2024).