View source for Anaerobna razgradnja izoftalata pri fermentacijski bakteriji Syntrophorhabdus aromaticivorans

Industrija je s svojo dejavnostjo uvedla številne okolju tuje snovi – ksenobiotike. V to skupino spadajo tudi izomeri estrov benzendikarboksilne kisline (ftalna kislina), kamor uvrščamo izoftalat, ki se v okolju akumulira že več kot 50 let. Estri ftalne kisline se uporabljajo kot plastifikatorji, za proizvodnjo topil, smol, tekstila, barv in vlaken. Tovrstne spojine se nalagajo v okolju in so glavni vzrok onesnaženja. Estri ftalne kisline in njihovi metaboliti slabo vplivajo na ljudi in živali, zato je njihova odstranitev iz okolja še kako pomembna za ohranjanje zdrave biosfere. 

<h2>Razgradnja estrov ftalne kisline</h2>
Estri ftalne kisline so podvrženi počasni abiotski razgradnji (npr. fotolizi). Nekateri specialnizirani aerobni mikroorganizmi pa so zmožni uporabiti te spojine kot substrat za rast in jih pretvoriti v nestrupene produkte. Identifikacija sodelujočih encimov ima pomembno ekološko vlogo za bioremediacijo. Aerobna razgradnja je precej raziskana, zato je v središču zanimanja anaerobna pot. Anaerobno razgradnjo izoftalata so proučevali pri striktnem anaerobu ''Syntrophorhabdus aromaticivorans''. Ta sev razgrajuje izoftalat in ostale aromatske spojine v sintrofiji z organizmom, ki porablja H2, npr. ''Desulfovibrio'' sp.  Razgradnja ftalatov poteka po benzoil-CoA poti.

<h2>Diferencialna proteomika kultur, ki so rasle v prisotnosti izoftalata in benzoata</h2>
Iz kultur, ki so rasle v prisotnosti izoftalata in benzoata (kontrola), so izolirali proteine in jih ločili z NaDS PAGE, da bi identificirali diferencialno inducirane proteine. V nadaljevanju so proteine razgradili s tripsinom in jih analizirali z LC-MS/MS. Spektralne podatke so primerjali s podatki iz baze s proteini ''S. aromaticivorans'' in kvalitativno določili nivo izražanja proteinov.

<h2>Encimski testi s celičnimi ekstrakti</h2>
Encimsko aktivnost so določali pod dušikovo atmosfero pri 37 °C. Vpliv kisika so preverili z inkubacijo vzorcev na zraku v oksičnem pufru. Proteine so izolirali z obarjanjem. Z LC-MS/MS so preverjali prisotnost izoftalil-CoA in benzoil-CoA. Metabolite so identificirali glede na retencijski čas in specifične MS/MS spektre. Nastanek izoftalil-CoA so kvantificirali glede na porabo koencima A, kjer so uporabili CoA kot standard. Podobno so naredili za benzoil-CoA, le da so za standard uporabili benzoil-CoA. 

<h3>Aktivnost izoftalil-CoA ligaze</h3>
Izoftalil-CoA ligaza katalizira pretvorbo izoftalata v izoftalil-CoA, za kar potrebuje energijo v obliki ATP. Reakcijo so merili spektrofotometrično, in sicer s sklopitvijo nastanka AMP z oksidacijo NADH v NAD+, pri čemer so odšteli intrinzično oksidacijo. Reakcijo so začeli z dodatkom substratov: izoftalata, o-ftalata, tereftalata ali benzoata, s čimer so preverili specifičnost. 
<h3>Aktivnost izoftalil-CoA dekarboksilaze</h3>
Izoftalil-CoA dekarboksilaza katalizira nastanek benzoil-CoA iz izoftalil-CoA. Celičnim ekstraktom so dodali pripravljene ftalil-CoA kot substrate in spremljali oksidacijo NADH kot pri izoftalil-CoA ligazi. 

<h2>Rezultati in zaključek</h2>
Z diferencialno proteomiko so določili več kot 400 diferenčno izraženih proteinov, od katerih so bili štirje izraženi izključno samo v ''S. aromaticivorans'', ki so rasle v prisotnosti izoftalata. To so fenilacetat:CoA ligaza, UbiD podobna dekarboksilaza, UbiX podobna flavin preniltransferaza in hipotetičen protein.
Z ''in vitro'' encimskimi testi so potrdili, da ''S. aromaticivorans'' aktivira izoftalat v izoftalil-CoA,  ki je nato dekarboksiliran v benzoil-CoA. Drugi korak katalizira dvokomponenten encimski sistem, sestavljen iz izoftalil-CoA dekarboksilaze in UbiX podobne flavin preniltransferaze. Slednja tvori prFMN, ki deluje kot kofaktor dekarboksilaze. Benzoil-CoA se dalje razgradi po poti, ki je dobro raziskana pri striktnih anaerobnih benzoat-fermentacijskih bakterijah. 

S filogenetsko analizo so ugotovili, da izoftalil-CoA dekarboksilaza  spada v družino funkcionalno raznolikih UbiD (de)karboksilaz. Homologe najdemo pri denitrificirajočih bakterijah, ki razgrajujejo aromatske spojine, organizmih, ki delujejo kot reduktorji sulfatov v morju, ter metanogenih mikrobih,ki razgrajujejo izomere izoftalata. Ti rezultati nakazujejo, da imajo mikroorganizmi prilagojene metabolne procese za razgradnjo ftalatov. Encimi za razgradnjo izoftalata se razlikujejo od encimov za razgradnjo izomera izoftalata o-ftalata z denitrificirajočimi bakterijami.

Glede na sintetičen izvor so mikroorganizmi dokaj hitro prilagodili metabolni sistem, ki kot substrat uporabi ftalate, ki vse bolj onesnažujejo okolje.

<h2>Viri:</h2>
M. Junghare, D. Spiteller in B. Schink: Anaerobic degradation of xenobiotic isophthalate by the fermenting bacterium ''Syntrophorhabdus aromaticivorans''. '''2019'''. doi: https://doi.org/10.1038/s41396-019-0348-5.