View source for BINANOX

Bionanox je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz Univerze v Leidenu. Dostopen je na spletnem naslovu https://2022.igem.wiki/leiden/.

= Problem =
Nanoterapevtiki se hitro pojavljajo na področju zdravljenja raka glave in vratu, saj si raziskovalci prizadevajo razviti zdravljenje, ki je zelo ciljno usmerjeno, manj invazivno in prilagodljivo posamezniku ter ima manj stranskih učinkov. Trenutne standardne oblike zdravljenja, kot so kemoterapija, radioterapija in kirurška odstranitev tumorja, so omejujoča zaradi toksičnih stranskih učinkov po zdravljenju in naraščajoče odpornosti ter neuspeha pri zdravljenju. S tem namenom so v okviru projekta Bionanox naredili mikrobno tovarno za proizvodnjo ježkom podobnih bimetalnih nanodelcev v brezceličnem sistemu, ki so primerni za fototermalno terapijo [1]. 

= Načrt dela =
Posebnost nanodelcev pri tem projektu je, da so sposobni pretvoriti svetlobo v toploto, kar pomeni, da so primerni za uporabo v fototermalni terapiji. V tem primeru bi nanodelci specifično ciljali tumorske celice, ki so nato izpostavljene laserju bližnjega infrardečega sevanja (NIR). Nanodelci pretvorijo svetlobo v toploto in ta toplota ubije tumorske celice [1]. Fototermalna terapija (PTT) je nov pristop, ki uporablja absorbente NIR svetlobe, ki lahko pretvorijo NIR svetlobe v toploto, proizvedena toplota pa odstrani rakave celice v procesu, ki se imenuje fotohipertermija. Kovinski nanodelci, na primer iz zlata ali srebra, so primerna sredstva za fototermalno terapijo in učinkovite NIR absorbente. Njihovo sposobnost absorpcije NIR svetlobe je mogoče dodatno povečati s spreminjanjem sestave in oblike nanodelcev. Cilj je bila izdelava bimetalnih nanodelcev, po obliki podobnih ježkom, sestavljenih iz srebrnega jedra in zlatih konic, saj zlate konice omogočajo dobro pretvorbo svetlobe v toploto, srebro pa ima protitumorske lastnosti [2]. Želeli so uporabiti mikrobno tovarno, zasnovano z gensko modifikacijo bakterije Escherichia coli za izražanje proteinov, ki reducirajo kovine, pridobljenih iz Candida albicans, in iz bakterije Cupriavidus metallidurans, ki je odporna na kovine. S poskusom biološke proizvodnje in spreminjanja strukture teh kovinskih nanodelcev so nameravali vzpostaviti platformo, namenjeno optimizaciji fototermalne terapije, ki je terapevtski pristop, ki ga je mogoče doseči le z nanotehnologijo [1].

= Potek dela =

== Proteini, ki reducirajo kovine ==
Bakterijske celice so sposobne reducirati kovinske ione v njihove elementarne oblike, kar je njihov način preživetja, saj so kovinski ioni zanje toksični. V projektu Binanox so ta naravni sistem uporabili tako, da so pripravili E. coli z geni, ki reducirajo kovine, ki so jih pridobili iz drugih organizmov, ki učinkovito reducirajo kovinske ione. Proteine, ki so jih identificirali, da reducirajo kovinske ione kot so zlato in srebro, so CopA, NapA in metalotionein. CopA so izbrali iz C. metallidurans, saj je bilo pokazano, da učinkovito reducira ione zlata ter se poveča njihovo izražanje pri izpostavljenosti zlatu. NapA so prav tako pridobili iz C. metallidurans in so izbrali, ker je dobra reduktaza predvsem srebra ter tudi zlata. Zadnji je metalotionein, ki je s cisteini bogat protein, ki veže kovine in jih je sposoben reducirati. Izbrali so ga iz C. albicans, saj pokazano dobro reducira kovine za proizvodnjo srebrnih nanodelcev.Skupaj so želeli uporabiti te tri gene za redukcijo kovin, da bi raziskali, ali so nastali proteini sposobni reducirati srebrove ione (pridobljene iz AgNO3) v srebrovo jedro, čemur sledi redukcija zlatih ionov (pridobljenih iz HAuCl4), da bi ustvarili zlate konice [1].

== Plazmidi  ==
Vse tri proteine je bilo treba najprej kodonsko optimizirati in dodati previsna zaporedja, da postanejo združljivi z ogrodjem plazmida. Kot donorski vektor so uporabili pJET 1.2 / blunt, kamor so ligirali zapise za CopA, NapA in metalotionein. Ta vektor vsebuje restrikcijski encimski gen Eco47I / T7, ki je letalen gen in ga je mogoče prekiniti z ligacijo inserta DNA na mesto kloniranja. Bakterijske celice, ki vsebujejo ta letalni gen, potem ne bodo mogle tvoriti kolonij, medtem ko bodo tiste, ki vsebujejo rekombinantni plazmid, tvorile kolonije, kar omogoča hitro in enostavno presejanje. Plazmide z zapisi za proteine so potem izolirali, izvedli restrikcijo in iz agaroznega gela izolirali ustrezne inserte. Inserte so vstavili v prejemni plazmid pET-16b. Ta plazmid je bil izbran, saj je standardni plazmid z nizkim številom kopij, ki zmanjšuje presnovno obremenitev gostiteljske celice. To je bilo pomembno, saj so bile bakterije obremenjene že z dodanimi srebrovimi in zlatimi solmi. Selekcijski marker je bil ampicilin. Inducibilni ekspresijski sistem je vseboval MCS, kjer so preko restrikcijskih mest BamHI in NdeI vstavili zaporedja za cup1 (zapisuje za metalotionenin), CopA in NapA. Vsebovalo je tudi promotor T7 za sprožitev transkripcije genov z dodajanjem izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG), gen lacI za sintezo lac represorja Lacl in mesto LacO. E. coli BL21 so transformirali s pripravljenimi plazmidi pET-16b-NapA in pET-16b-CopA. Za cup1 jim ligacija s pJET 1.2 / blunt ni uspela in plazmida niso uspeli pripraviti [1]. Transformacija nato ni bila uspešna, zato so v nadaljnih eksperimentih uporabili gene, izbrane iz zbirke ASKA, ki je celoten komplet ORF-jev iz E. coli K-12, in izbrali so gene za napA, melA, cueO in copA [3]. 

== Biološka sinteza nanodelcev v brezceličnem sistemu ==
Njihov splošni pristop je bila biološka sinteza proizvodnje nanodelcev v brezceličnem sistemu. Uporabili so supernatant iz tekoče kulture seva divjega tipa (WT) E. coli BL21, ki so ga čez noč gojili v štirih različnih gojiščih (LB, LB z nizko vsebnostjo soli, MH in TSBS) pri 37 °C. Supernatant je bil uporabljen za ustvarjanje brezceličnega sistema za proizvodnjo nanodelcev. Supernatant E. coli, gojen v gojišču MH, je pokazal večjo absorbanco, kar kaže, da je najbolj učinkovit za proizvodnjo nanodelcev. Po opravljenih meritvah absorbance smo transmisijskim elektronskim mikroskopom (TEM) uporabili za preučevanje oblikovanih nanodelcev, ki so pokazale nastanek nanodelcev, od katerih so nekateri vsebovali konice. Poleg tega je bila opažena velikost nanodelcev okoli 100 nm, ki je primerna velikost za PTT. 
V naslednjem eksperimentu je bil supernatant iz tekoče kulture WT E. coli BL21 dopolnjen s celičnim lizatom, ki je vseboval gen, izbrani iz zbirke ASKA. Torej je bila poskusna biološka proizvodnja bimetalnih nanodelcev narejena z uporabo zbirke ASKA. Nazadnje so tej reakcijski mešanici dodali ione Ag+ in Au+ in jih pustili 24 ur za proizvodnjo nanodelcev. Poskusi so pokazali, da dodajanje celičnih lizatov, ki vsebujejo proteine, ki reducirajo kovine, ni povzročilo povečane proizvodnje nanodelcev, kot je bilo predvidevano [1].

= Optimizacija in rezultati =
Ugotovili so, da je  optimalno razmerje med zlatom in srebrom 1,85:1, optimalni pH je 5 in temperaturo 49 °C. Poleg tega so pokazali, da se supernatant E.coli BL21 najbolje obnese v gojišču MH, saj je bila najvišja absorbanca pri 800 nm, slike TEM pa so potrdile nastanek koničastih nanodelcev velikosti okoli 100 nm. Ti definirani optimalni pogoji so bili uporabljeni v nadaljnjih poskusih. Celični lizati, ki so vsebovali proteine, ki reducirajo kovine, so bili uvedeni v supernatant E. coli BL21 WT, vendar niso pokazali izboljšanja proizvodnje nanodelcev. To lahko povzročijo celični lizati, ki vsebujejo komponente, ki motijo delovanje proteinov ali sintezo nanodelcev, ali razgradnja proteinov, ki reducirajo kovine [1].

Pri že omenjeni fototermalni terapiji se svetloba laserja pretvori v toploto z nanodelci, lokaliziranimi na tumorskih celicah. Ko temperatura tumorskih celic doseže 42-43 °C, se proteini v celicah denaturirajo, kar vodi do akutne in kronične celične poškodbe in na koncu do celične smrti [4]. Dokazali so dva koncepta in sicer absorbanco in proizvajanje toplote. Nanodelci, proizvedeni z to metodo biološke sinteze, so pokazali absorbanco v bližnjem infrardečem območju in so bili sposobni pretvoriti bližnjo infrardečo svetlobo v toploto. Laser osvetljuje tumor s svetlobo bližnjega infrardečega (NIR) spektra, saj druge valovne dolžine svetlobe poškodujejo žile in zdravo tkivo. Poleg tega bo NIR svetloba prodrla globlje v tkivo kot vidna svetloba, zaradi česar je ta valovna dolžina primerna za PTT, saj lahko doseže tumor in aktivira nanodelce. To je posledica minimalnega absorpcijskega koeficienta melanina, hemoglobina in molekul vode v območju NIR. Območje NIR lahko razdelimo na dve okni, ki delujeta za PTT. Prvo okno (λ= 650-850 nm) je optimalno za površinske tumorje, z največjo globino 2-3 cm pod kožo, kar je bilo tudi ciljno za ploščatocelični karcinomi predstavljajo 90 % vseh rakov glave in vratu, ki predstavlja ciljno tarčo tega projekta. Izbirali so temu primerno valovno dolžino 800 nm. Izdelani nanodelci niso izpolnjevali vseh želenih lastnosti za PTT, saj nekateri nanodelci niso bili podobni ježkom in so nastajali agregati. Vendar pa je toplotni eksperiment pokazal, da so nanodelci sposobni pretvoriti svetlobo laserja NIR v toploto s spremembo v temperaturi za 7,1 °C in učinkovitostjo pretvorbe PTT 44,3 % [1].

= Cilji za prihodnost =
Med laboratorijskim delom niso uporabljali inhibitorjev proteaz, da bi preprečili razgradnjo reducirajočih proteinoc pri razgradnji bakterijskih celic. To je verjetno povzročilo slabe rezultate v poskusih brez celic, zato bi v prihodnosti dodali inhibitorje proteaz. Eden izmed ciljev bi bil tudi pridobivanje stabilnih koncentracij nanodelcev v večjih volumnih kot je 10 litrov, saj so taki rezultati nato prenesljivi na 1000 litrske bioreaktorje. Poleg tega želijo najti optimalno metodo izolacije in sterilizacije, da bi dobili čiste nanodelce, ki jih je mogoče uporabiti v medicini.

= Viri =
[1] BIONANOX https://2022.igem.wiki/leiden/

[2] Cheng, L. C., Huang, J. H., Chen, H. M., Lai, T. C., Yang, K. Y., Liu, R. S. & Tsai, D. P. (2012). Seedless, silver-induced synthesis of star-shaped gold/silver bimetallic nanoparticles as high efficiency photothermal therapy reagent. Journal of Materials Chemistry, 22(5), 2244-2253.

[3] Kitagawa, M., Inamoto, E., Ioko, T., Arifuzzaman, M., & Ara, T. (n.d.). (2022). Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (a complete set of E. Coli K-12 ORF archive): Unique Resources for Biological Research. DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes.

[4] He, X., Wolkers, W. F., Crowe, J. H., Swanlund, D. J. & Bischof, J. C. (2004). In situ thermal denaturation of proteins in dunning AT-1 prostate cancer cells: implication for hyperthermic cell injury. Ann. Biomed. Eng. 32, 1384–1398.