View source for BiFC

UVOD

Rastlinski odgovor na stres je kompleksen in v njem sodeluje veliko genov in veliko biokemijskih molekularnih mehanizmov. V tej študiji so raziskovali možnost, da na razgradnjo nukleinskih kislin, ki jo povzroča od kalcija odvisna nukleaza (AtCaN2) lahko vpliva inhibitor cisteinske proteaze oz. cistatin (ATCYSb). Uporabili so polno dolžino AtCYSb kot vabo v dvohibridizacijskem sistemu s kvasovkami in identificirali številne možne interakcije, ena od katerih je bila interakcija z AtCaN2. Odločili so se, da to interakcijo podrobneje preučijo in jo potrdijo, saj do tedaj ni bilo objavljenega še nobenega poročila o interakciji med inhibitorjem cisteinske proteaze in nukleazo. Interakcija je bila potrjena z testom "pull down" in BiFC. Efekt AtCYSb na AtCaN2 pa z gelsko elektroforezo. Vse študije so potekale na oz. z rastlino Arabidopsis. 
Rastlinski cistatini regulirajo endogene cisteinske proteaze med razvojem semena in kaljenjem, regulirajo tudi programirano celično smrt. Inhibirajo eksogene proteaze v prebavnem traktu insektov, povečujejo odpornost na škodljivce in glive, pripomorejo tudi k obrambi proti abiotičnim faktorjem. 

BIOMOLEKULSKA FLUORESCENČNA KOMPLEMENTACIJA (BiFC)

BiFC se uporablja za potrditev interakcije med proteini pa tudi za lokalizacijo, kje se ta interakcija v celici dogajajo. Osnova je fluorescirajoč protein (npr. GFP ali YFP) razdeljen na dva dela (N- in C- del), ki se ne moreta sestaviti spontano. Polovici sta povezani vsaka z enim od para proteinov med katerima želimo dokazati interakcijo. Naredimo torej fuzijo dela flurescirajočega proteina z enim od proteinov in vstavimo oba kompleksa v žive celice. Če pride med raziskovanima proteinoma do interakcije, bo to združilo tudi oba delca fluorecirajočega proteina, ki bo, ponovno sestavljen, emitiral fluorescenčni signal.
V tej raziskavi so vektor ustvarili z zamenjavo GFP v pBS-35S-GFP z N- koncem ali C- koncem fluorescirajočega proteina mVenus. Dobili so pBS-35S:VN154 in pBS-35S:VC80. ORF AtCYSb je bil pomnožen s PCR s primerjema 5'-CCCGGGAGAATGATGAGAAG-3' and 5'-ACTAGTGTCATGGTGTTGCT-3' (SmaI and SpeI). PCR produkt je bil obdelan z restriktazama in kloniran v SmaI-SpaI mesto pBS-35S:VN154, nastane pBS-35S:AtCYSb-VN154. AtCaN2 so dobili iz pQE-30-AtCaN2, obdelani z KpnI in SalI, AtCaN2 ORF je bil vstavljen v KpnI-SalI mesto pBS-35S:VC80, dobimo pBS-35S:AtCaN2-VC80. 
Interakcija je bila opazovana v rastlinskih celicah in sicer v čebulnih epidermnih celicah. Kot kontrolo so uporabili samo fluorescirajoč protein (cel). Fluorescenca je bila opažena, ko sta bila oba proteina skupaj izražena v čebulnih celicah, podobno kot pri fluorecsirajočem proteinu razporejenem po citosolu. Ta rezultat potrjuje interakcijo med proteinoma. 

RNA IZOLACIJA IN NORTHERN BLOTTING

Za analizo ekspresije genov je bilo izbrano rastlinsko tkivo (Arabidopsis thaliana) v različnih stadijih rasti. 

AtCaN2 mRNA ekspresija je bila opažena v različnih stadijih rasti Arabidopsis rastlinskega tkiva. AtCaN2 mRNA ni bila izražena v mladih koreninah in mladih semenskih ovojih. Malo AtCaN2 mRNA je bilo v mladih listih, mladih steblih in odraslih semenskih ovojih, veliko pa v odraslih listih in steblih. Opazovali so tudi ekspresijo AtCaN2 mRNA pod stresom. Kot stresne dejavnike so uporabili 10mM NaHCO3, 10mM H2O2 in mraz (4°C). Analize so bile izvedene takoj po izpostavitvi stresnemu dejavniku, ter potem na vsake 6h (po 6, 12, 24h). Pri NaHCO3 je AtCaN2 ekspresija v listih dosegla maximum po 6h, nato pa upadla. V koreninah pa so se kazale visoke vrednosti pri analizi po 6h in 12h. Pri H2O2 je v listih ekspresija dosegla maximum po 6h, nato upadla in zopet narasla po 24h. V koreninah je bilo največ mRNA po 6h, vrednost pa je bila visoka še 24h. Ko so Arabidopsis izpostavili mrazu, pa so pri listih in koreninah dobili najvišje vrednosti po 24h. Rezultati tako pokažejo, da je AtCaN2 vpletena v odzive na stresne faktorje. 

ZAKLJUČEK

Potrdili so, da je od kalcija odvisna nukleaza v Arabidopsis del odgovora rastline na stresne dejavnike. Potrjena je bila tudi interakcija med navedeno nukleazo in inhibitorjem cisteinske proteaze. Ta interakcija je bila do sedaj prvič potrjena. Nadaljnje študije so potrebne, za raziskovanje kako natančno sta AtCYSb in ATCaN2 vpletena v obrambi proti abiotičnim dejavnikom. Rezultati so pomembni za razumevanje obrambnega mehanizma rastlin proti različnim stresom iz okolja. 

VIR

Guo, K., Bu, y., Takano, T., Zhang. X., (2013) Arabidopsis cysteine proteinase inhibitor AtCYSb interacts with a Ca2+-dependent nuclease, AtCaN2. FEBS Letters 587, 3417-3421