View source for BioSynthAge - Kvalitetno staranje. Tina Kuhar (6.12.2016)

<h2>UVOD </h2>
Staranje je tema, ki je privlačila skupino UCL iz Londona. Njihov cilj je bil prispevati k kvalitetnemu staranju, torej, da bi biološko staranje, kar v največji meri izključevalo hude bolezni tipične za staranje. Mednje sodijo Alzheimerjeva bolezen, osteoporoza in izolirana sistolična hipertenzija (1).
Staranje je po definiciji proces, pri katerem začnejo po reproduktivni zrelosti organizma usihati mnoge fiziološke funkcije telesa skladno s starostjo organizma (2). Za celično staranje je značilna zmanjšana količina proizvedene energije v mitohondrijih, slabša sposobnost celične delitve in zato kopičenje poškodb DNA, kopičenje poškodovanih beljakovin, akumulacija netopnih molekul v celicah in zmanjšana sinteza novih beljakovin (3). 
V zadnjih letih se je življenjska doba podaljšala, vendar pa še vedno 2/3 populacije umre zaradi hudih posledic bolezni, ki so tipične v starosti, kar pa je tesno povezano s kvaliteto življenja starostnika in njegovih bližnjih. Skupina je preučila dejavnike, ki privedejo do staranja in poiskala rešitve, ki potencialno vodijo do kvalitetnejšega staranja. Osredotočili so se na bistvene točke za zametek bolezni in na organe, ki so najbolj dovzetni za bolezni v starosti.
V pljučih so tako preučevali rešitev, ki jo ponuja genska terapija s prekomernim izražanjem encima superoksid dismutaze 3. Naredili so tudi sistem za povečano proizvodnjo likopena (močan antioksidant) v črevesju. Hipertenzijo so skušali zmanjšati s povečanim izražanjem esencialne aminokisline L-arginina. S proizvodnjo bakteriocina so kontrolirali zdravje ustne votline (1).

<h3>Oksidativni stres</h3>
Osnovni mehanizem staranja je povezan z reaktivnimi kisikovimi spojinami (ROS) in prostimi radikali. Oboji nastanejo pod vplivom okolja in povzročajo oksidativni stres v organizmu. ROS aktivirajo gene, ki so udeleženi pri vnetnem odzivu ali pa povzročijo poškodbe na DNA, proteinih in lipidih (2). Ker se s staranjem zmanjšuje tudi aktivnost DNA popravljalnih mehanizmov (3), v končni fazi pride do genomske nestabilnosti, kar se konča z apoptozo ali z pretvorbo celice v rakavo celico (2).

<h4>Vpliv na proteine</h4>
Skupina je preko dinamičnega sipanja svetlobe (DLS) opazovala strukturo proteinov ob oksidacijskem stresu, ki so ga izzvali s 5mM vodikovim peroksidom. Rezultati so pokazali, da se struktura proteina (monoklonskega protitelesa) ob stresu spremeni. In sicer iz pravilno zvitega proteina nastanejo veliki agregati proteinov in majhni nestabilni intermediati. 
Ker s starostjo oksidativni stres narašča, je proteinska struktura čedalje bolj okrnjena, kar vodi v zmanjšanje aktivnosti vitalnih proteinov to pa v bolezen. 
Zato je zmanjševanje oksidacijskega stresa logična tarča za vsesplošno ohranjanje zdravja (1). 

<h4>Obramba pred oksidacijskim stresom</h4>
Pred ROS se telo brani z encimi superoksid dismutazo, katalazo in glutation peroksido. Nevtralizirajo pa jih tudi antioksidanti (glutation, vitamin E in C, karotenoidi (npr. likopen), glutation) in L-arginin (4). 
<h4>'''Likopen'''</h4>
Likopen je eden izmed najmočnejših antioksidantov, ki sadju daje rdečo barvo (paradižnik, lubenica). Obarvan je zaradi konjugiranih dvojne vezi, ki sicer omogočajo dušenje ROS in nas zato varuje pred oksidativnim stresom in staranjem. Študije kažejo, da dieta s povečanim vnosom likopena zniža tveganje za rakom prostate, želodca in pljuč (5). 
Skupina pa je želela povečati koncentracijo likopena s pomočjo sintezne biologije. Pripravili so biokocko z zapisom za likopen pod NarK promotorjem, ki aktivira izražanje likopena v odgovor na oksidativni stres. Celice E. coli so transformirali s pripravljenim plazmidom, te pa bi pacient zaužil s probiotikom. 
Po pripravi biokocke, so preverjali preživetje transgenih celic v stresnih pogojih v primerjavi z celicami divjega tipa. Stres so ustvarili s hipoksijo, z medijem z 2mM bakrovim kloridom (CuCl2) in z 50 ter 100µM natrijevim nitroprusidom (SNP). V odvisnosti od časa so spremljali optično gostoto. Spektrofotometrično pa so lahko zaradi obarvanosti likopena spremljali naraščanje koncentracije likopena z naraščanjem optične gostote.
Rezultati so dokazali, da likopen omogoči rast celic v stresnih pogojih, saj ščiti celice pred oksidativnim stresom. Njegovo izražanje pa se s stopnjo stresa povečuje, kar bi predvidoma celicam omogočilo preživetje v črevesju (1).
<h4>'''L-arginin'''</h4>
L-arginin je esencialna aminokislina, pomembna pri vzdrževanju celične homeostaze. Dokazano namreč pomanjkanje te aminokisline vodi v povečano koncentracijo ROS in zmanjšano koncentracijo antioksidantov v celici (6). Dodatki L-arginina izboljšajo simptome kardiovasklarne bolezni (hiperzenzijo), ki je najpogostejši vzrok smrti na svetu. 
Skupina je sintetizirala sistem treh biokock, ki bi povečano izražala L-arginin. Tudi tu bi se poslužili vnosa s probiotikom. Pri tem se je osredotočila na glavna mehanizma, ki preprečujeta masovno sintezo L-arginina v celicah. In sicer na represijo NAGS encima s strani L-arginina (negativna povratna zanka) in na represor ArgR. ArgR je pogost represor encimov, ki sodelujejo v biosintezi L-arginina. Prva biokocka torej predstavlja mutagenizirano verzijo NAGS encima, ki je odporen na inhibicijo s strani L-arginina. Druga je vezavno zaporedje za represor ArgR, ARG box. Tretja biokocka pa je pripravljena za sintezo transportrskega proteina, ki bi L-arginin prenesel iz celice ven. 
<h4>'''Superoksid dizmutaza (SOD)'''</h4>
SOD so treh vrst glede na to, kje se nahajajo in so pomembni v boju proti ROS. SOD je skupino začela zanimati, zaradi dejstva, da so nekatere mutacije v SOD3 povezane s poslabšano pljučno funkcijo pri odraslih in večjo nagnjenost k KOPB, povečana količina divjega tipa SOD3 pa prispevajo učinkovitejši nevtralizaciji ROS, ki se s staranjem kopičijo. 
Skupina se je povečane ekspresije SOD3 lotila z gensko terapijo. Konstruirali so sistem lentivirusnega vektorja z genom SOD3. Ta konstrukt bi v pljuča vnesli z inhalacijskim sredstvom, tam pa bi se vgradil v DNA in se konstutivno izražal v pljučnih epitelnih celicah (tkivno-specifični promotor). Aplikacija preko inhalatorja ima prednost v hitrosti dostave. Da so lažje spremljali učinkovitost transfekcije so encimu SOD3 pripeli še GFP reporter.

<h4>Vpliv na nastajanje zobnih plakov</h4>
Ustna votlina je dobro gojišče za mnoge mikroorganizme, ki sintetizirajo zunajcelični polisaharidi matriks, ki jim omogoča tesen stik s zobno površino, kar ustvari matrični biofilm. Kopičenje biofilna za bakterije, ki živijo pod njim, pomeni stres. Posledično pride do lokalizacije metabolitov in lokalno nižjega pH-ja in naseljevanja acidofilnih Gram pozitivnim bakterij. Nižji pH pa vodi do demineralizacije, do zobnega kariesa in na koncu do paradontalne bolezni, ki pa je rizični faktor za nekatere sistemske bolezni. 
Cilj skupine je bila določitev indikatorja za patalogijo v ustni votlini, da bi lahko glede tega regulirali sproščanje antimikrobnega peptida mutacina 3. Rešitev so poiskali v spremljanju pH. Ugotovili so, da kot pH senzor lahko služi promotor Spy, ki regulira izražanje gena (v poizkusu GFP) v odvisnosti od pH. 
Da bi povečali specifičnost, so vezje kasneje preoblikovali tako, da zelena fluorescenčna svetloba inducira nastanek modre, katero mi zaznavamo. Bistvo principa vodi CcaS (histidinska kinaza), ki se aktivira ob zeleni svetlobi in katalizira fosforilacijo CcaR (odzivni regulator). To se kaže v aktivaciji izražanja modrega fluorescentnega proteina, ki je voden s PcpcG2 promotorjem. 

Mutacin3 je protein učinkovit v boju z Gram pozitivnimi bakterijam. Vezje za biosintezo mutacina 3 vsebuje strukturni gen mutA, ki omogoča sintezo prepropeptida (C-konec vsebuje propeptid, pred iznosom proteina v medij pa se odcepi še signalni peptid z N-konca). Kontranskripcijska enota mutBCDP omogoča razločevanje mutacina3 od drugih bakteriocinov preko delovanja encimov na peptid kodiranih v tem lokusu MutBCDP; Encim, ki ga kodira zapis MutB katalizira dehidracijo peptida, MutC pa ciklizacijo propeptidnih serinskih in treoninskih ostankov, ki se lahko kondenzirajo s sosednjimi cisteinskimi ostanki. To privede do tvorbe tioesterskih mostov. Encim, ki ga kodira mutD katalizira oksidativno dekarboksilacijo C-terminalnih cisteinskih ostanov, medtem ko je produkt mutP zapisa serinska proteaza, ki cepi signalni peptid. Slednja je zadnja stopnja v biosintezi. Zrel mutacin 3 ima obročasto strukturo z gibljivimi povezavami (linkerji) med podenotami. Ta giblivost je pomembna za baktericidno aktivnost. V membrani tvori transmembranske pore, kar vodi v izplavljanje celičnih komponent (1).

 <h2>Zaključek </h2>
Osnovni mehanizem staranja je povezan z reaktivnimi kisikovimi spojinami (ROS) in prostimi radikali. Ti so zelo reaktivni, reagirajo z DNA, lipidi in proteini ter tako povzročajo oksidativni stres. Proti temu se telo brani z antioksidanti in popravljalnimi mehanizmi.  V primeru neravnovesja med prooksidativnimi in antioksidativnimi procesi v celici pride do apoptoze ali pa do nekaterih boleznih, kot so Alzheimerjeva bolezen, osteoporoza, hipertenzija, diabetes, kancerogene bolezni idr. Ker se s staranjem oksidativni stres povečuje, se povečuje tudi nagnjenost do naštetih bolezni (2). Da se starali kvalitetno je skupina razmišljala in gradila na procesih, ki vključujejo predvsem obrabo pred oksidativnim stresom.


 <h2>VIRI </h2>
(1) http://2016.igem.org/Team:UCL, dostopno: december 2016
(2) http://www.zrss.si/bzid/geni/pdf/sersa-clanek.pdf, dostopno: december 2016 
(3) J, L. Gerson S, The role of DNA damage repair in aging of adult stem cells 2007. Nucleic Acids Res. Dec; 35(22): 7557–7565.
(4) Balasaheb Nimse S, Pal D, Free radicals, natural antioxidants, and their reaction mechanisms 2015. RSC Ad. May, 27986-28006
(5) http://www.bhia.org/lycopene.htm , dostopno: december 2017
(6) A, Das S, Roy S. Deprivation of L-Arginine Induces Oxidative Stress Mediated Apoptosis in Leishmania donovani Promastigotes: Contribution of the Polyamine Pathway 2016. PLoS Negl Trop Dis. Jan; 10(1): e0004373.