View source for CAT-Seq: Visokoprepustna metoda za analizo katalitske aktivnosti biomolekul

[http://2018.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania-OG CAT-Seq] je projekt skupine iz Vilne, ki je bil predstavljen in nagrajen na tekmovanju iGEM 2018.

= Metoda CAT-Seq =

'''CAT-Seq''' (''Catalitic activity sequencing'') je visokoprepustna metoda za analizo katalitske aktivnosti biomolekul. Ideja metode je povezati katalitsko aktivnost biomolekul z molekulo DNA, ki jo kodira, tako da sta na isti molekuli shranjeni informaciji o zaporedju in aktivnosti biomolekule. To omogoča hitro anotacijo velikih DNA knjižnic. Pri tem je možno kot katalitsko molekulo uporabiti katalitično DNA, RNA ali protein. Za uporabnost metode za analizo velikih knjižnic encimov je potrebno sintezo biomolekul in reakcije sinteze nove molekule DNA načrtovati na mikroravni. Rešitev za ta problem so raziskovalci iz Vilne našli v mikrofluidiki.

Aktivnost biomolekule je bila torej povezana z nukleotidi. Za DNA polimerazo je značilno, da se določeni nukleotidi, ki so modificirani, ne vključijo v DNA. Nukleotid z vezanim substratom, ki je dovolj velik, da onemogoči vključevanje v DNA, so poimenovali ''Substrate nucleotide'' ('''nukleotid-substrat'''). Ker DNA polimeraza ne more uporabiti nukleotid-substrata, bo količina nastale DNA odvisna od količine prisotnih nukleotidov brez vezanega substrata – ''Product Nucleotide'' ('''nukleotid-produkt'''). Hitrost nastajanja nukleotid-produktov je odvisna od hitrosti reakcije razgradnje nukleotid-substrata, ki jo pospešuje biomolekula. Načrtanje nukleotid-substrata je torej zelo pomemben proces, ki omogoča uporabo metode za različne encime.

== Teoretsko ozadje metode ==

Metoda CAT-Seq je kompleksen pristop sestavljen iz več stopenj. Za poglobljeno razumevanje metode je torej pomembno pojasniti posamezne stopnje.

=== Priprava DNA knjižnic ===

Za začetek je potrebno pripraviti DNA knjižnico za analizo. Knjižnica mora vsebovati zapise za mutantne oblike enakega encima, katalitične RNA ali DNA. Opisan postopek predvideva sintezo proteinov, vendar se lahko modificira tudi za uporabo za analizo katalitskih RNA in DNA. Na začetek kodirajočega zaporedja se nato z ligacijo ali PCR doda promotor in vezavno mesto za ribosom (RBS). Na koncu se celotna molekula DNA cirkularizira. Cirkularizacija je potrebna zaradi uporabe metod ''Multiple displacement amplification'' ('''MDA''') za podvojevanje DNA (izotermna metoda, da ne pride do prelomov DNA) in ''Rolling cycle transcription'' ('''RCT''') za sintezo RNA. Obe metodi bosta opisani kasneje.

=== Enkapsulacija v kapljice ===

Z uporabo kapljične mikrofluidike se ujame molekule DNA iz knjižnice v piko- in nanolitrske kapljice. To omogoča izolacijo posamezne kodirajoče DNA iz knjižnice v omejen sistem za potek reakcije. Pri tem je pomembno, da se v eni kapljici ne nahaja več molekul DNA iz knjižnice, ker bi tako prišlo do napake pri rezultatu. Pomembno je, da so v vsaki kapljici prisotni reagenti za sintezo biomolekule (IVTT), DNA molekula iz knjižnice in nukleotid-substrat. Kapljice se ustvarijo v posebni napravi, ki uravnava pretok dveh tekočin: vodne faze z reagenti in inertnega olja. Pri mestu stekanja tekočin se ustvarijo majhne kapljice vodne faze. Tako se lahko v 10 minutah ustvari do 300000 vodnih kapljic, ki se jih lahko shrani v 1,5 mL epico, kjer se inkubirajo na določeni temperaturi.

=== Proizvodnja katalitske biomolekule in pretvorba nukleotidov ===

Sinteza proteinov iz ene molekule DNA je zelo neučinkovita. Kot rešitev za ta problem so raziskovalci uporabili RCT. Pri tej tehniki se molekula DNA z RBS in promotorjem na začetku, vmesnim kodirajočim delom in brez transkipcijskega terminatorja na koncu pripravi v krožni obliki. Pri transkripciji tako nastaja dolga RNA molekula s številnimi ponovitvami enake kodirajoče regije. Tako se na hiter način sintetizira veliko osnov za translacijo, kar na koncu vodi do večjega izkupička pri tvorbi proteinov.
Med inkubacijo za sintezo biomolekule hkrati poteče tudi pretvorba nukleotid-substrata v nukleotid-produkt. Količina nastalega produkta je premo sorazmerna z aktivnostjo mutante encima.

=== Zapisovanje informacij ===

Nukleotid-produkte je potrebno nato sestaviti v molekulo DNA. Za uspešno pomnoževanje je potrebno naknadno dodati reagente za pomnoževanje, ki bi drugače motili sintezo biomolekule. V ta namen je potrebno združiti kapljice z reagenti z že pripravljenimi kapljicami z nukleotidi. 
Za kvantifikacijo rezultatov je v tej stopnji potrebno dodati še referenčne nukleotide. To so nukleotidi, ki so modificirani, vendar se kljub modifikaciji lahko vključijo v DNA. Ti omogočajo, da bo v vseh kapljicah zadostna količina nukleotidov za sintezo DNA. Enaka količina DNA je pomembna, da ne pride do pristranskosti pri sekvenciranju. Pomembno je, da se v vsako kapljico doda enako količino referenčnih nukleotidov, saj je na koncu pomembno razmerje med referenčnimi in produktnimi nukleotidi. Razmerje bo visoko v prid produktnih nukleotidov pri mutantah z visoko aktivnostjo in nizko pri mutantah z nizko aktivnostjo. Razmerje bo ohranjeno tudi v nastali molekuli DNA, zato bo možno s sekvenciranjem določiti učinkovitost mutante.
Za pomnoževanje DNA je bila uporabljena metoda MDA, saj uporablja konstantno temperaturo za pomnoževanje. S spreminjanjem temperatura bi se lahko porušila stabilnost kapljic, zaradi česar bi prišlo do združevanja le teh.

=== Sekvenciranje rezultatov ===

Kot metoda sekvenciranja je najprimernejša metoda Nanopore sequencing. Prednost te metode je možnost sekvenciranja dolgih molekul DNA brez potrebe po fragmentiranju in sposobnost ločevanja modificiranih nukleotidov od navadnih. 
V ta namen se kapljice preprosto združi in skoncentrira DNA. Vodna raztopina se nato analizira s sekvenatorjem. Ker referenčni nukleotidi pri tem dajejo drugačen signal kot navadni, se lahko določi razmerje obojih.

== Preizkus metode v praksi ==

Za preizkus uporabnosti metode v praksi je bilo potrebno metodo testirati na izbranem paru encim-substrat. V ta namen je bila najprej analizirana knjižnica encimov z določenim substratom. Po izbiri reakcijskega para so bile pripravljene mutante, ki so bile analizirane z metodo CAT-Seq in klasičnimi, že uveljavljenimi metodami z manjšim pretokom.

=== Izbira primernega encima ===
Za izbiro encima je bila najprej in vitro pripravljena knjižnica hidrolizirajočih encimov. H knjižnici so dodali izbran substrat - N4-benzoil-2'-deoksicitidin trifosfat. Ob cepitvi substrata se je odcepila organska molekula, ki je zaradi benzenovega obroča absorbirala svetlobo pri valovni dolžini 310 nm. Aktivnost encimov je tako lahko bila določena spektroskopsko. Na tak način je bil izbran najučinkovitejši encim, poimenovan RM537. Encimu so bile nato določene aktivnostne konstante iz Michaelis-Mentenovega, Lineweaver-Burkovega in Hanes-Woolfovega grafa. Na enak način so bile analizirane tudi mutante encima z zmanjšano aktivnostjo. Te aktivnosti so na koncu uporabili za primerjavo z rezultati metode CAT-Seq.

=== Priprava regulatorne regije ===

Da bi preverili možnost analize regulatornih regij z metodo CAT-Seq, je bilo analiziranih še 9 parov Toehold-aktivirajočih regij. S spektroskopskimi meritvami aktivnosti so ugotovili, da je regulacija uspešna, saj je prišlo do nastanka encima samo v ustreznih parih, medtem ko pri ostalih primerih ni bilo zaznane encimske aktivnosti.
Z encimskim testom po opravljeni in vitro transkripciji in translaciji so bili primerjani 4 RBS.

=== Enkapsulacija in sinteza biomolekule ===

Pripravljena je bila raztopina IVTT, DNA in nukleotid-substratov. S konstantnim pretokom raztopine in fluoniranega olja so bile pripravljene kapljice velikosti pL v emulziji. Raztopina in pretoki so bili pripravljeni tako, da je na koncu bila prisotna 1 molekula DNA v vsaki 10. kapljici. Emulzija je bila shranjena v mikrocentrifugirkah pri 37˚C za 4 ure, da je potekel nastanek biomolekule in razgradnja nukleotid-substratov. 
Zaradi slabega izkupička in vitro sinteze proteinov v kapljici je bila primerjana sinteza iz linearne in cirkularne oblike. V ta namen je bila spektroskopsko določena hitrost razgradnje nukleotid substrata po in vitro sintezi encima iz vsake od oblik DNA. Sinteza iz cirkularne oblike je bila pokazana kot 3 krat učinkovitejša.

=== Zapisovanje informacij ===

Eksperimentalno določanje pogojev za uspešno združevanje kapljic je zahteven proces in vključuje določanje 4 različnih pretokov in električnega polja, ki bodo primerni za uspešno združevanje kapljic. Optimalni pogoji za združevanje kapljic so bili določeni z matematičnim modeliranjem.
Kot referenčni nukleotidi so bili dodani metilirani citidini.
Za določitev koncentracije in razmerja nukleotidov je bila najprej določena količina nukleotid-substrata. Za to je bila najprej pri visoki koncentraciji referenčnih nukleotidov določena mejna koncentracija nukleotid-substratov. Nato je bila določena najnižja možna koncentracija referenčnih substratov pri enaki koncentraciji nukleotid-substratov. Sinteza DNA je bila nato s temi koncentracijami  preizkušena v 50 pL kapljicah. Rezultati elektroforeze so pokazali bolj jasno liso kot pri reakciji v raztopini celotne DNA knjižnice.
Pri pomnoževanju DNA je pomembno, da nukleotid-substrati ne ovirajo sinteze in da se po razgradnji vključijo. To je bilo pokazano na mikro- in makroravni z elektroforezo.

=== Sekvenciranje in določevanje dinamičnega razpona ===

Z uporabo tehnike Nanopore je bila analizirana pripravljena knjižnica po poteku opisanih reakcij.
Za določitev dinamičnega razpona je bil s sekvenciranjem izmerjen še metilacijski vzorec po uporabi MDA z različnimi koncentracijami nukleotidov. Dokazano je bilo, da izbrane koncentracije nukleotid-substrata in referenčnega nukleotida omogočajo dovolj velik razpon rezultatov za uporabnost metode.

=== Določitev aktivnosti CAT-Seq esteraze ===

Rezultati so pokazali, da meritve z metodo CAT-Seq dobro ustrezajo spektroskopskim meritvam. Aktivnosti posameznih mutant so prakazane na grafu. Večja odstopanja med rezultati meritve aktivnosti so prisotni pri mutantah z nižjo aktivnostjo. Prav tako je bila potrjena ustreznost metode za določevanje moči mesta za vezavo ribosoma in Toe-hold transkripcijskega regulatorja.