View source for Case13a Sistem za zaznavanje genov za odpornost proti antibiotiku

(Nina Roštan)
Povzeto po projektu: [http://2017.igem.org/Team:TUDelft Projekt iGEM 2017, ekipa TU Delft]<br>
==Uvod==
Po podatkih WHO organizacije je problematika odpornosti bakterij proti antibiotikom danes ena največjih groženj za globalno zdravje in varnost preskrbe s hrano. Cilj ekipe TU Delft na iGEM je bil reševati problem odpornosti na antibiotike s pomočjo sintezne biologije. Prvi korak k temu cilju je zmanšanje uporabe antibiotikov, ko niso nujni. Osredotočili so se na mlekarsko industrijo. Najpogostejša bolezen v mlekarski industriji je mastitis, ki je okužba kravjih vimen. Testiranje ali je okužba za določeno kravo z mastitisom povzročena z bakterijami, ki so odporne na antibiotik, je trenutno drag in težak proces. Zato običajno kmet najprej kravo zdravi s standardnimi antibiotiki. Ko ti ne delujejo, bo kmet šele poslal vzorce mleka podjetju, specializirano za diagnostiko. Po analizi vzorcev bi nato tretirali kravo z bolj primernim antibiotikom. Ekipa se je zato osredotočila na izdelavo sistema, ki na mestu zlahka in hitro odkrije gene za odpornost na antibiotike.

==Cas13a==
Za metodo detekcije genov za odpornost na antibiotike so se odločili za CRISPR-Cas sistem. Nekateri Cas proteini imajo sposobnost, da najdejo specifično RNA ali DNA sekvenco s pomočjo vodeče RNA oziroma crRNA. Ko Cas protein najde svojo ciljno DNA ali RNA, ki ustreza vodeči RNA, ciljno DNA ali RNA razcepi. Primeri teh Cas proteinov, ki imajo funkcijo iskanja in rezanja so Cas9, Cpf1 in Cas13a. Prva dva ciljata DNA, medtem ko Cas13a cilja RNA. Ekipa se je odločila za Cas13a, ki cilja RNA, po rezanju ciljne RNA pa se podvrže konformacijski spremembi in prične nespecifično rezati preostale RNA, s katerimi se sreča. Ta funkcija naredi Cas13a primerno tudi za detekcijo specifične RNA, saj je lahko aktivirana le s pomočjo specifične ciljne molekule. Po aktivaciji pa pride do iniciacije kolateralnega cepljenja molekul RNA, kar se lahko uporabi za tvorbo signala, ki ga je mogoče zaznati. Ekipa je pripravila biokocko z zapisom za Cas13a protein. Za promotor so izbrali LacUV5, ki se ga pogosto uporablja v Cas sistemih, za RBS mesto so izbrali RBS za nižjo raven izražanja. Pred sekvenco za protein so dodali zaporedje za His značko, mesto za trombin, strep značko in SUMO mesto za cepitev, ki omogočajo očiščenje proteina. Po sekvenci za protein Cas13a sledi dvojni terminator in obrnjena CRISPR sekvenca z dvema dolgima ponovitvama in vmesno sekvenco, ki se jo lahko spremeni glede na vodečo RNA, ki jo želimo uporabiti, saj ima dve restrikcijski mesti.

==Dizajn projekta==
===Iskanje motiva===
Geni bakterij, ki so odgovorni za odpornost proti določenim antibiotikom, so dobro znani in dokumentirani. Z detekcijo teh genov lahko predvidimo, ali bo določen antibiotik učinkovit ali ne. Tako bi lahko spodbudili usmerjeno uporabo antibiotikov in delno preprečili širjenje odpornosti proti antibiotikom. Iskanje motivov je problematično, saj se geni, ki kodirajo enako odpornost na antibiotike, v manjši meri razlikujejo. Ekipa je v ta namen razvila programsko orodje, ki med različicami odpornega gena identificira ohranjeno regijo. Ohranjene regije se nato naknadno pregleda, če lahko ustrezajo vodeči RNA na Cas13a proteinu. Nazadnje so zanesljivost sistema za odkrivanje ustrezne ciljne RNA ocenili s pomočjo biofizikalnega modela, ki napoveduje verjetnost pridobitve lažno pozitivnega rezultata. Ekipa je poudarila, da je modeliranje ključnega pomena za podporo laboratorijskemu delu projekta, saj želijo uporabiti sekvence vodeče RNA, ki usmerjajo Cas13a zgolj proti želenemu cilju.

===Priprava vzorca===
Da lahko Cas13a odkrije gene, odporne na antibiotike, potrebuje ciljno RNA. Ker lahko trenutne metode zaznajo samo aktivne gene, so želeli razviti metodo, ki bo sposobna zaznati prisotnost patogene DNA, tudi če ta ni aktivna. Iz okuženega mleka je potrebno DNA izolirati, ciljno DNA pa je potrebno namnožiti in prepisati v RNA. Sestavili so protokol, kjer bi DNA izolirali z segrevanjem celic na 100°C (z mikrovalovko), nato bi vzorec centrifugirali, DNA pa bi ostala v supernatantu. Nato bi DNA pomnožili s pomočjo rekombinaza polimeraza amplifikacijo (RPA), alternativa PCR, ki se jo lahko uporabi pri konstantni temperaturi 37°C in zazna tako RNA kot DNA. Oligonukleotide bi načrtali tako, da bi med pomnoževanjem vstavili tudi promotorsko mesto za T7 polimerazo. Z dodatkom T7 polimeraze bi prepisali ciljno DNA v RNA. S to pripravo vzorca je RNA sintetizirana ob konstantni temperaturi na mestu in ne potrebujemo termocikla.

===Koacervacija in metoda CINDY Seq (Coacervate Induced Nucleotide Detection of Your Sequence)===
Ime koacervat (ang. coacervate) izhaja iz latinske besede coacervare, ki pomeni »zbrati skupaj ali gruča«. Koacervat je kapljica, ki nastane v tekočini z neenako gostoto sestavin ali zaradi različnega naboja molekul. Ekipa je razvila metodo CINDY Seq, ki uporabi ta biokemijski fenomen. Dolgi negativno nabiti polimeri (vključno RNA) v kombinaciji s pozitivno nabitimi polimeri fazno separirajo v koacervate, bogate s polimeri. Ti koacervati povečajo motnost raztopine do te mere, da jo lahko opazimo z golim očesom. 
Cas13a se aktivira, ko z vodečo RNA najde ciljno RNA in jo cepi. Po aktivaciji prične cepiti vse RNA molekule, ki jih sreča in jim tako prepreči, da bi prišlo do koacervacije po dodatku pozitivno nabitih molekul, saj so RNA molekule prekratke, raztopina pa bo ostala bistra. Če pa se Cas13a ne aktivira (ko ne najde ciljne RNA), pa bo raztopina postala motna.

===TDP (Tardigrad specifični intrinzično neurejeni proteini)===
Drugi del zagotavljanja sistema, ki je primeren za gospodinjsko uporabo, je zagotovitev, da je sistem enostavno prevažati in shranjevati, ne da bi ovirali njegovo funkcionalnost.
Tardigradi oziroma počasniki, znani tudi kot vodni ali vesoljski medvedki, so mikro živali sposobne preživeti številne ekstremne pogoje, med katerimi je tudi dehidracija. Nedavno so identificirali skupino Tardigrad-specifičnih proteinov, ki nimajo terciarne strukture. Tardigradi jih prozvajajo po sušenju in tvorijo steklasto matriko, ki ščiti celične sestavine. iGEM ekipa je izbrala več TDP proteinov, od katerih fragmente so naročili in izrazili v E. coli, jih izolirali ter očistili. TDP proteine so nato posušili s Cas13a proteini. Po sušenju z določenimi TDP proteini je Cas13a ohranila RNAzno aktivnost, vendar izgubila specifičnost. Ne glede na te proteine, so bili rezultati pozitivni za en TDP protein in sicer SAHS 33020, saj je po sušenju protein Cas13a znatno ohranil aktivnost in specifičnost.

===Vezikli===
Kot je tipično za sintezno biologijo, si je ekipa zamislila, da bi imeli bakterijo, ki bi vse njihove potrebne proteine (Cas13a in TDP) pridobila skupaj v paketu. Kot paket so si zamislili vezikle zunanje membrane. E. coli bakterije, proizvajajo vezikle zunanje membrane, vendar premalo in premajhne za proizvodnjo proteinov v veziklih. Zato je ekipa želela ustvariti celice, ki bi proizvajale več veziklov (hipervezikulacija), vezikle pa bi povečali iz premera od 80 do 100 nm v velikost premera od 115 do 300 nm. Glede hipervezikulacije so starejša znanstvena dela pokazala, da mutacije v genih, ki kodirajo proteinske komplekse odgovorne za stabilnost bakterijske celične stene (Tol-Pal kompleks), destabilizirajo zunanjo membrano in imajo celice več veziklov. Za destabilizacijo membrane je zato potrebno le izbiti gen za TolA protein. Za povečanje veziklov pa je lanska iGEM ekipa iz Avstralije pripravila biokocko, ki vsebuje zapis za prekomerno izražanje TolR gena, ki povzroči produkcijo večjih veziklov. Kombinacija izbitega TolA gena in prekomerno izraženega TolR gena, povzroči hipervezikulacijo veziklov velikosti do 300 nm v premeru, ki naj bi glede na računalniški model ekipe iz Delfta, lahko zajel od 80 do 900 Cas13a proteinov.

=====Prenos proteina v vezikle=====
Vezikli se proizvajajo v periplazmi, zato morajo biti proteini, ki jih želijo v veziklih, preneseni v periplazmo. Ekipa se je odločila za Tat pot. Zamislili so si, da bi pripravili fuzijski protein s TorA značko za eksport na N koncu. Fuzijski protein se v citoplazmi zloži v terciarno strukturo, nato pa se prenese v periplazmo skozi poro, ki jo tvorijo TatC proteini. Značka za eksport se nato odcepi. Da bi ekipa preverila, ali se bo protein transportiral v vezikle, so pripravili fuzijski protein TorA-GFP. Ekipa je kombinirala GFP-TA vključek v sevu divjega tipa in KEIO sevu. Preverili so, če se protein večinsko nahaja v veziklih. Po indukciji GFP-TA proteina so odfiltrirali vezikle. Rezultati so pokazali, da je intenziteta fluorescenc signifikantno višja v KEIO sevih v primerjavi z divjim tipom, ki nima TolR mutacije. Ekipa je tako lahko zaključila, da se GFP uspešno prenese v vezikle.

==Zaključek==
Namen projekta je bil, da razvijejo varno in zanesljivo metodo za zaznavanje genov, rezistentnih na antibiotik. Da so dosegli visoko specifičnost so uporabili protein Cas13a. Da so poiskali najbolj primerne vodeče RNA so razvili iskalec motiva, ki identificira ohranjene regije v bakterijskih genih, ki omogočajo rezistenco na antibiotik. Za oblikovanje signala so uporabili fenomen koacervacije, jo optimizirali in razložili biofizikalne principe. Da se lahko orodje shranjuje za dlje časa so uporabili TDP proteine tardigrada, da zaščiti Cas13a proteine. V njihovem predvidenem končnem izdelku se bakterije uporabljajo kot celične tovarne tako, da jim omogočajo proizvodnjo in izločanje vseh potrebnih proteinov v majhnih veziklih. 

==Literatura==
1. [http://2017.igem.org/Team:TUDelft Projekt iGEM 2017, ekipa TU Delft]<br>
2. Baker, J., Chen, L., Rosenthal, J., Putnam, D., & DeLisa, M. (2014). Microbial biosynthesis of designer outer membrane vesicles. Current Opinion In Biotechnology, 29, 76-84. doi:10.1016/j.copbio.2014.02.018<br>
3. Boothby, T., Tapia, H., Brozena, A., Piszkiewicz, S., Smith, A., & Giovannini, I. et al. (2017). Tardigrades Use Intrinsically Disordered Proteins to Survive Desiccation. Molecular Cell, 65(6), 975-984.e5. doi:10.1016/j.molcel.2017.02.018<br>
4. Gootenberg, J., Abudayyeh, O., Lee, J., Essletzbichler, P., Dy, A., & Joung, J. et al. (2017). Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, 356(6336), 438-442. doi:10.1126/science.aam9321<br>