View source for E.

== Uvod ==

Ekipa iGEM iz Zuricha je pri svojem projektu predstavila E. coli, ki je tarčno usmerjena na rakave celice. Gre za novo vrsto bakterijske terapije za zdravljenje raka, ki locira, vizualizira in uničuje trdne tumorje. CATE vsebuje nepatogeni sev bakterije E. coli Nissle, ki ima intrinzično sposobnost, da se prednostno nahaja v tumorjih. Ima dve kontrolni točki v mehanizmu delovanja, ki zagotavljata, da se poškodujejo le tumorske celice. CATE potuje po ožilju in se kolonizira v tumorjih. Ko se akumulira dovolj bakterij v tumorju, se te izpostavijo in postanejo »vidne« ter se pripravijo za citotoksičen »payload«.
Po slikanju tumorja z magnetno resonanco, lahko zdravnik aktivira »payload«. Ekipa je sestavila gensko vezje, ki distribuira dve sintetični dna zaporedji. Vse funkcije so bile testirane in optimizirane, da bi bilo vezje čim bolj varno v praksi. Pri tem projektu so ustvarili kar 14 novih biokock, od tega največ hibridnih promotorjev.

== PREDSTAVITEV PROJEKTA CATE ==

Bakterije so lahko sprogramirane, tako da dostavijo različne tovore na specifične lokacije na različne načine. CATE je ustvarjena tako, da prepozna tumor, akumulira proti-rakave toksine in jih na ukaz dostavi preko »heat senzorja«. Da dejansko pride do sprostive substance iz bakterije v okolje se uporabijo prednosti sekrecijskih mehanizmov bakterij ali pa se bakterijo inžinirsko modulira tako, da lizira ob določenem zunanjem signalu.
Pri CATE so ustvarili sinteznobiološko vezje, ki združuje signale zunaj in znotraj telesa. Vključuje dve kontrolni točki, za preprečitev ne tarčenga delovanja. Vezje vsebuje naslednje dele: 


•	Zaznavanje tumorja (Tumor sensing)

•	MRI kontrastni agent (MRI contrast agent)

•	Anitkancerogeni toksin (Anti-cancer toxin)

•	Toplotni senzor (Heat sensor)

•	Liza celic (cell lysis)


Genski konstrukti se nahajajo na dveh plazmidih, na pogonskem in na regulatornem plazmidu. Genski zapisi za kontrolo obnašanja se nahajajo na regulatornem plazmidu. Ta vključuje luxR, IldP in IldR, ki so ustvarjeni da kontrolirajo funkcijo in-vrat (tumor senzor) in tlpA (toplotni senzor). Pogonski plazmid vsebuje gene za delovanje CATE. Ti geni zapisujejo za bakterioferitin (MRI kontrastni agent), azurin (anikancerogeni toksin) in protein E (liza celic). Na tem plazmidu je še gen za LuxI, ki omogoča zaznavanje celične gostote. 

== NAČRT PROJEKTA CATE ==

Strukturiranje je potekalo v treh fazah. V prvi fazi je šlo za aplikacijo teoretičnih modelov in za eksperimentalno delo. V drugi faksi so testirali napovedi modelov in zbrali podatke. Sledila je optimizacija posameznih delov za izboljšanje njihove funkcionalnosti. Projekt je bil zasnovan v hierarhičnem bottom-up inženirskem pristopu. Vezje so razdelili na dele glede na različne funkcije in jih izpopolnjevali do želenih kriterijev.

FAZA I: Začetni načrt
Za logična vrata IN so dizajnirali genetski zapis za hibridni promotor.
Želeli so doseči čist signal pri MRI detekciji. Za optimizacijo ekspresije so uporabili plazmid, ki izraža bakterioferitin in RBS iz Salis Lab RBS Calculator. 
FAZA II: Testi in optimizacija
V tej fazi so spreminjali nivoje izražanja proteinov z knjižnicami RBS-jev oz. z različnimi dizajni promotorjev.
•	Testrali so sistem zaznavanja »kvoruma«, da bi našli sprožilno točko pri kateri se aktivira IN promotor 
•	Optimizirali so RBS za »heat senzor« za bi zmanjšali puščanje promotorja in na ta način kontrolirali protein E
•	Izmerili so AHL odvisnost od doze od bakteriofeitin regulatornega promotorja da bi zagotovili da je promotor aktivno inducibilen
•	Naredili so protein E rbs knjižnico, da bi našli različice, ki jih bi lahko regulirali z »heat senzorjem« brez takojšnega uničenja celic po transformaciji
•	Modelirali so difuzijo toplote v okoliška zdrava tkiva za tri ure pri 45 °C, tako so preverili če bi tak način zdravljenja vplival na zdrave celice v okolici

FAZA III: Demonstracija funkcij
•	Po MRI slikanju so dokazali da bakterioferitin izražen v našem sevu dejansko vodi izrazitega zmanjšanja v MRI signalu, kar prikaže njegovo uporabnost kot MRI kontrastni agent v in vitro in potrdi potencialno uporabo v in vivo uporabi pri detekciji tumorjev
•	Pripravili so rbs knjižnico ekspresijskih nivojem tlpA
•	Dokazali so da lahko bakterija raste pri 37 °C ob transformaciji z »heat-inducible« sistemom za lizo celic. Po segrevanju na 45 °C celice lizirajo in sprostijo vsebino v okolico.

== CATE INŽINIRING ==

=== Del za zaznavanje tumorja ===
Pomembno je da so zagotovili hibridni promotor, ki se vgrajuje v in-vrata, ki imajo za vhodni signal L-laktat in AHL. Ključno je to, da promotor zazna razliko v koncentraciji vhodnih signalov pri tumorskih in zdravih celicah. Promotor so sestavili iz že obstoječe biokocke BBa_K1847007 (del zaznavnega sistema za laktat) in iz pLux promotorja (zaznavanje celične gostote). Ta promotor je reguliran preko LldR in LuxR. LldR se veže na operatorja O1 in O2 in tako ustvari dna zanko, ki skrije mesta za vezavo transkripcijskih aktivatorjev. Ob prisotnosti laktata se ta zanka sprosti, saj se laktat veže na LldR in ga konformacijsko spremeni. Bakterije E. coli TOP10 so transformirali z regulatornim in pogonskim plazmidom, ta omogoča avtonomno zaznavanje gostote. Kulture so rastle čez noč v gojiščih z variabilno koncentracijo glukoze in laktata.

S tem eksperimentom so dokazali delovanje hibridnega promotorja in njegovo odvisnost na koncentracijo laktata, saj se je pri 5 mM koncentraciji (takšna konc. je prisotna v rakavem tkivu) laktata izrazilo bistveno več gfp-ja kot pri 1 mM koncentraciji (zdravo tkivo). Tako so tudi dokazali, da bi njihov sistem uspešno razlikoval med zdravim in tumorskim tkivom.
=== MRI kontrastni reagent ===
Kot kontrastni reagent so uporabili bakterioferitin, ki bi zdravniku sporočil, da so bakterije lokalizirale pravo tumorsko tkivo, da so bakterije dosegle zadostno koncentracijo in da lahko proizvedejo dovolj antikancerogenega toksina. Ta toksin je lokaliziran na istem plazmidu kot bakterioferitin, zato se sočasno začneta izražati.
 
=== Antikancerogeni toksin ===
Sintetično ustvarjen promotor PAND omogoča izražanje azurina ob prisotnosti laktata in visoki celični gostoti v tumorskem tkivu. Ko zdravnik preko MRI zazna pravilno lokacijo CATE in zadostno koncentracijo bakterij bo preko usmerjenega ultrazvoka sprožil lizo celic in sprostitev azurina v okolico.

=== Toplotni senzor ===
Usmerjen ultrazvok povzroči lokalno povišanje temperature na 45 °C, kar je aktivacijska temperatura za toplotni senzor, ki so ga ustvarili za CATE. Senzor je sestavljen iz TlpA in proteina E. TlpA je represor proteina E. Senzor deluje tako, da je pri določeni T inhibicija onemogočena in protein E se lahko izraža. Senzor so testirali pri različnih temperaturah in so ugotovili, da je pri 45 °C dosežena najvišja stopnja lize celic.
=== Liza celic ===
Njihovo orožje je protein E, ki ga proizvaja fag Phi X 147, ki v naravi lizira gostiteljsko celico po produkciji fagnih delcev. Zanj so se odločili, ker je že bil uspešno implementiran za lizo celic v inženirsko spremenjenih bakterijah. Protein E aktivira komponento avtolitičnega sistema E. coli, ki inhibira sintezo celične stene, podobno kot penicilin oz. oligomerizira in tvori transmembranski tunel, skozi katerega se sprosti citoplazma. Najverjetnejša tarča proteina E je encim translokaza I, ki ga zapisuje mraY gen. Translokaza I ima vlogo pri gradnji celične stene in njegova inhibicija povzroča lizo celice.

== ZAKLJUČEK ==

Pri projektu jim je uspelo dokazati, da njihov sistem CATE s sintetično ustvarjenim toplotnim promotorjem zelo natančno deluje pri specifični temperaturi 45 °C in povzroči sprostitev 70% vsebine toksina iz celic po 3h inkubaciji na 45 °C.  Sproščanje toksina se zagotovo nadaljuje tudi po 3h, torej bi bil ta odstotek v realnosti nekoliko višji. Uspelo jim je tudi dokazati, da je protein E ustrezno kontroliran preko TlpA in je liza celic onemogočena pri 37 °C, v kolikor TlpA inhibira izražanje proteina E.

== VIRI ==
http://2017.igem.org/Team:ETH_Zurich

http://parts.igem.org/Part:BBa_K2500003

https://en.wikipedia.org/wiki/Quorum_sensing