View source for Ekspresijska kaseta za sintezo heterolognih proteinov v Y. lipolytica

izhodiščni članek: [https://doi.org/10.1021/acssynbio.5c00612 Omics-Based Expression Cassette for Heterologous Protein Production in Y. lipolytica] 

== Uvod ==
Rekombinantni heterologno proizvedeni proteini so ključni za raziskave, v prehrambni in farmacevtski industriji ter biotehnologiji. Zato se strmi k razvoju sistemov za proizvodnjo z visokim donosom proteinov z ohranjeno nativno konformacijo in funkcionalnostjo. Učinkovito sintezo lahko ovirajo neučinkovita raba kodonov, nestabilnost mRNA, nepravilno zvitje proteinov ter odsotnost ali neustrezne posttranslacijske modifikacije (PTM). Te težave lahko precej uspešno zaobidemo z izražanjem v evkariontskih gostiteljskih sistemih, zlasti v kvasovkah, ki združujejo kompleksnost evkariontov in enostavnost rokovanja bakterijskih sistemov.

=== Yarrowia lipolytica kot gostiteljski organizem ===
Kvasovka Y. lipolytica je dimorfni netradicionalni modelni organizem, ki je prepoznavnost pridobil zaradi učinkovitega izločanja proteinov v zunajcelični prostor, robustne presnove lipidov ter odpornosti na različne stresne pogoje. V primerjavi s pogosteje uporabljenima kvasovkama S. cerevisiae ali K. phafii, omogoča boljšo sekrecijsko pot in pravilnejše zvitje proteinov. Za razliko od S. cerevisiae, za katero je značilna hipermanozilacija, Y. lipolytica na proteine pripenja krajše in bolj homogene sladkorne verige, kar zmanjšuje imunogenost proteinov. Y. lipolytica ima status GRAS (splošno priznana kot varna), dodatna prednost pa je tudi rast na širokem naboru kompleksnih substratov.

Kljub njenim prednostim se Y. lipolytica ne uporablja pogosto, saj je nabor orodij za gensko inženirstvo še vedno omejen. Z namenom širjenja uporabnih genetskih elemetnov so avtorji članka s pristopi »omike« identificirali nove promotorje, terminatorje in signalne peptide ter jih združili v optimizirano ekspresijsko kaseto YALI-pSTOmics1.

== Identifikacija in karakterizacija promotorjev ==

=== Transkriptomska analiza ===
Največjo težavo pri uporabi Y. lipolytica kot gostiteljskega sistema predstavlja nabor promotorjev, ki je omejen na šibke, inducibilne in umetno pripravljene hibridne promotorje.

Za identifikacijo novih promotorskih zaporedij so uporabili podatke pridobljene z metodo 5’-CAGE (Cap Analysis Gene Expression), ki omogoča opredelitev moči promotorja glede na število transkriptov. Metoda 5'-CAGE razkrije transkriptomske podatke tako, da ujame 5'-konce mRNA, ki se z reverzno transkripcijo prepišejo v cDNA in nato poravnajo na genom. Za razliko od standardne RNA-seq analize 5'-CAGE omogoča natančnejšo določitev mest začetka transkripcije (TSS). Avtorji članka so analizirali javno dostopne podatke TSS, ki so jih pridobili iz podatkovne baze YeastTSS in promotorje razvrstili glede na TPM (tags per million), ki odraža število transkriptov s posameznega promotorja. Devet najmočnejših kandidatov, ki zajemajo promotorje genov za ribosomalne proteine in proteine toplotnega šoka, so anotirali in nadalje karakterizirali.

=== Določanje moči promotorjev ===
Število transkriptov odraža moč promotorja, vendar so za učinkovitost translacije ključne tudi 5'- neprevedene regije (5'-UTR). Moč promotorjev so preverili z merjenjem intenzitete fluorescence reporterskega proteina Discosoma sp. Red (DsRed). 

Zasnovali so konstrukte, kjer so genomske regije dolžine 1,5 kb navzgor od START kodona kombinirali z zapisom za DsRed in jih integrirali v genom. Fluorescenco so na ravni posamezne celice detektirali s pretočno citometrijo. Pet izmed devetih promotorjev (pDDRA2, pCyC, pS11, pSED1 in pL41) je izkazalo višjo aktivnost kot kontrolni promotorji z nizkim TPM. Rezultati so pokazali, da med TPM in količino sintetiziranega proteina ni neposredne korelacije, kar poudarja pomen učinkovitosti translacije in stabilnosti mRNA.

Izstopal je predvsem promotor ribosomalnega proteina L41 (pL41) s skoraj 10-krat višjo aktivnostjo kot ostali promotorji. To verjetno odraža naravno vlogo pL41 pri intenzivni sintezi ribosomov med hitro rastjo celic. pL41 so nadalje testirali in primerjali raven izražanja z najmočnejšimi uveljavljenimi promotorji Y. lipolytica (pTEF-in, pEXP, hibridni promotorji UASB8-TEF in hp4d). pL41 je izkazal znatno višjo fluorescenco kot vsi omenjeni promotorji, kar ga opredeljuje kot potencialen nov standard za močan konstitutivni promotor.

=== Robustnost in vsestranskost pL41 ===
Robustnost pL41 so testirali s primerjanjem aktivnosti v različnih pogojih. pL41 je obdržal status najučinkovitejšega promotorja v treh različnih fazah rasti (eksponentna, stacionarna in pozna stacionarna faza) v bogatem gojišču YPD in minimalnem gojišču YSC. Prav tako ni prišlo do znižanja fluorescence v minimalnem gojišču Delft in industrijsko relevantnih hidrolizatih repičnega pogačnika v primerjavi z bogatim gojiščem YPD. Stabilnost v različnih gojiščih potrjuje uporabnost za industrijsko proizvodnjo.

Vsestranskost pL41 so ocenili s sekretornim izražanjem različnih heterolognih proteinov (npr. albumin, fetuin A). Proteine so označili z N-terminalnim signalnim peptidom XPR2-prepro ter s C-terminalno oznako HiBiT. HiBiT je manjši fragment luciferaze, ki se ob prisotnosti proteina v zunajceličnem prostoru veže na večji del razcepljene luciferaze, kar povzroči luminescenco in tako omogoča enostavno detekcijo in kvantifikacijo (sistem razcepljene luciferaze). Izločanje proteinov je bilo sicer v vseh primerih uspešno, vendar razlike nakazujejo na vpliv lastnosti posameznega proteina. Glede na rezultate lahko sklepamo, da pL41 učinkovito spodbuja robustno in vsestransko gensko ekspresijo v Y. lipolytica in bi lahko bil primeren za različne biotehnološke aplikacije.

== Identifikacija in karakterizacija terminatorjev ==
Terminatorji pomembno vplivajo na izražanje genov, saj omogočajo hitro ločitev RNA polimeraze II od nastajajoče mRNA ter izboljšujejo stabilnost in razpolovni čas mRNA. 

Kljub visokim vrednostim TPM so nekatere promotorje povezali z nizkimi ravnmi sintetiziranih proteinov, kar pomeni, da sama transkripcijska aktivnost ni zadosten pokazatelj izkupička sinteze proteina. Ta opažanja bi lahko pripisali različnim regulatornim elementom 5′-UTR, vendar k visokim vrednostim TPM pomembno prispevajo tudi terminatorji in pripadajoče 3′-UTR regije. To znanje je avtorje spodbudilo, da so iz genskih regij z visokimi vrednostmi TPM anotirali učinkovite terminatorje.

Terminatorske regije so definirali kot približno 1 kb dolge genomske regije navzdol od STOP kodona. Te regije so klonirali v ekspresijsko kaseto z zapisom za humaniziran GFP R. reniformis (HrGFP) pod nadzorom promotorja pL41. Za oceno učinkovitosti terminacije so navzdol od terminatorja dodali še zapis za reporter DsRed brez lastnega promotorja, kar je omogočilo kvantifikacijo »puščanja« terminatorja. V primeru »puščanja« RNA polimeraza ne prekine transkripcije, temveč nadaljuje prepisovanje zaporedja za DsRed.

Za analizo terminatorski zaporedij so uporabili pretočno citometrijo in kvantitativni PCR (qPCR), saj terminatorji vsebujejo več STOP kodonov, kar otežuje detekcijo fluorescenčnega signala DsRed brez notranjega vezavnega mesta za ribosom (IRES). qPCR je metoda, ki omogoča pomnoževanje in hkratno kvantifikacijo DNA v realnem času na podlagi merjenja fluorescence vezane DNA sonde. Štirje izmed petih testiranih terminatorjev so omogočili višje izražanje zapisa za HrGFP kot običajno uporabljena terminatorja CyC in TEF. Izstopal je predvsem terminator GST-podobnega proteina (tGST), saj je omogočal najvišjo fluorescenco in najmanjše "puščanje". Razmerje med izražanjem zapisa za HrGFP in »puščanjem« je dobro koreliralo s fluorescenco HrGFP. Fluorescenca je bila šibkejša pri terminatorjih, ki so bolj »puščali«, kar je posledica daljšega časa translacije in kompleksnejše strukture transkriptov. Vzrok puščanja bi lahko bila tudi prisotnost kriptičnih promotorskih zaporedij znotraj terminatorskih regij, zato avtorji poudarjajo potrebo po dodatni karakterizaciji terminatorjev.

== Optimizacija izločanja s signalnimi peptidi ==
V zadnjem delu so se osredotočili na identifikacijo novih signalnih peptidov, saj učinkovitost izločanja v zunajcelični prostor močno vpliva na donos rekombinantnega proteina in olajša postopke čiščenja.

Izbor novih signalnih peptidov je omogočila analiza sekretoma divjega tipa kvasovke Y. lipolytica v kombinaciji z genomskimi podatki in bioinformatskimi napovedmi. Analiza genske ontologije (GO) šestintridesetih identificiranih ekstracelularno izločenih proteinov je razkrila, da so te proteini primarno vpleteni v procese pridobivanja hranil in sintezo celične stene - pogosto gre za hidrolitične encime ter encime za podaljševanje polisaharidov.

Za oceno sekretorne učinkovitosti so izbrali 13 signalnih peptidov. Učinkovitost signalnih peptidov so nato preizkusili na dveh proteinih s HiBiT-oznako na C-koncu: govejem fibroblastnem rastnem faktorju 2 (FGF2), ki nima kompleksnih PTM in proteinu napin3 (Nap3) z disulfidnimi mostički. Kombinacije zapisa za protein in signalni peptid so vključili v vektor s promotorjem pL41 in terminatorjem Tpex2. Učinkovitost so opredelili glede na referenčno izločanje s signalnim peptidom XPR2-prepro. Kot močne signalne sekvence so obravnavali tiste, ki so presegle prag za oba proteina. Zgolj štirje signalni peptidi (YALI0_A20350g (Lip2), YALI0_F12067, YALI0E00110p (fosfolipidna hidrolaza), YALI0D20680p (glukan-1-3 beta-glukozidaza)) so omogočili izboljšano izločanje tako za FGF2 kot tudi za Nap3. Ti rezultati nakazujejo, da univerzalni signalni peptid ne obstaja. Razlike v učinkovitosti signalnih peptidov je mogoče pripisati drugačni kinetiki zvijanja proteinov in interakcijam med C-koncem signalnega peptida in N-končnim zaporedjem tarčnega proteina, kar vpliva na učinkovitost translokacije v ER ali učinkovitost cepitve s signalno peptidazo.

== Ekspresijska kaseta ==
Promotor pL41, terminator tGST in najprimernejše signalne peptide so nazadnje združili v ekspresijsko kaseto YALI-pSTOmics1 in tako ustvarili sistem, ki znatno presega zmogljivost trenutno dostopnih komercialnih in raziskovalnih vektorjev združljivih z Y. lipolytica. Uporabnost ekspresijske kasete so dokazali s sekretorno sintezo ključnega rastnega faktorja za proizvodnjo gojenega mesa FGF2. Raven sinteze FGF2 iz YALI-pSTOmics1 so primerjali z najsodobnejšo kombinacijo pTEFin, XPR2-prepro in Tpex20. Kaseta YALI-pSTOmics1 je omogočila trikrat višjo sintezo FGF2 v primerjavi z referenčno kombinacijo (pTEFin, XPR2-prepro in Tpex20).

== Zaključek ==
Čeprav rezultati temeljijo na omejenem naboru proteinov, jasno izpostavljajo potencial pristopa. Za proizvodnjo kompleksnejših proteinov bi bilo smiselno testirati več regulatornih zaporedij, da bi dosegli najboljšo združljivost in čim višje donose. Prav tako kombinacija izbranih elementov v ekspresijski kaseti ni imela popolnoma aditivnega učinka, kar odraža omejitve celične sekrecijske in translacijske kapacitete. To je posledica preobremenitve mehanizma translokacije in zvijanja proteinov, zaradi številčnosti mRNA, kar je pomembno upoštevati pri načrtovanju optimiziranih konstruktov.

Avtorji članka so s svojim delom uspešno identificirali nove regulatorne regije za proizvodnjo proteinov v sistemu kvasovke Y. lypolitica. To odpira nove možnosti za uporabo sistema, ki ob cenovni dostopnosti združuje lastnosti kompleksnih gostiteljskih sistemov in enostavnost bakterijskega sistema. S tem se Y. lypolitica uvršča na vidno mesto kot potencialni gostiteljski sistem za proizvodnjo heterolognih proteinov v raziskovalne in industrijske namene z visokim donosom.

== Literatura ==
[1]	R. Elemosho idr., „Omics-Based Expression Cassette for Heterologous Protein Production in Y. lipolytica“, ACS Synth. Biol., let. 15, št. 2, str. 499–510, feb. 2026, doi: 10.1021/acssynbio.5c00612.

[2]	„CANDIDA | Yarrowia lipolytica (Candida lipolytica)“, str. 374–378, jan. 2014, doi: 10.1016/B978-0-12-384730-0.00056-2.

[3]	H. Takahashi, T. Lassmann, M. Murata, in P. Carninci, „5’ end-centered expression profiling using Cap-analysis gene expression (CAGE) and next-generation sequencing“, Nat. Protoc., let. 7, št. 3, str. 542–561, feb. 2012, doi: 10.1038/nprot.2012.005.

[4]	G. Blogger, „Exploring Applications of the Bioluminescent HiBiT Tag“. Pridobljeno: 3. maj 2026. [Na spletu]. Dostopno na: https://blog.addgene.org/exploring-applications-of-the-bioluminescent-hibit-tag