View source for FISHERLY

V okviru tekmovanja iGEM 2022 je skupina 20 študentov iz Univerze znanosti in tehnologije Hong Kong leta 2022 predstavila izven celični kolorimetrični biosenzor za preverjanje kakovosti morske hrane z imenom FISHERLY. Projekt je dostopen na spletnem naslovu https://2022.igem.wiki/hkust/ . 

==Problem==
Leta 2021 je Hong Kong uvozil 33 000 ton in proizvedel 112 000 ton rib, je tudi osmi največji porabnik rib na svetu. Velik problem predstavljajo količine zavrženih rib zaradi bojazni pred zastrupitvami z bioamini. Zavrženih je približno 14 500 ton rib letno, s čimer bi lahko nahranili ve kot milijon ljudi. Trenutne metode za zaznavanje pokvarjenih rib se lahko izvajajo v laboratorijih ali izven njih. Preiskave v laboratorijih lahko potekajo do pet dni. Instrument za kvaliteto kontrole izven laboratorija omogoča hitrejše rezultate, vendar se njegova uporaba zaradi visoke cene ni razširila med uporabnike. Rešitev bi lahko predstavljala hitra, učinkovita in poceni metoda [1].

==FISHERLY==
Fisherly je izven celični kolorimetrični senzor s katerim lahko zaznavamo visoke koncentracije bioaminov, ki nastanejo pri dekarboksilaciji aminokislin. Zastrupitve z bioamini so povzročene predvsem s histamini, putreskini in kadaverini. Ljudje, ki zaužijejo pokvarjene ribe trpijo za glavoboli, drisko in bruhanjem. 
Fisherly je tri-fazni procesor. Vsebuje element za zaznavanje signalov in njihovo pretvorbo v znotrajcelične transkripcijske signale, element za pretvorbo signalov in element, ki daje izstopni signal [1].

===Zaznavni element===
Potreben je za zaznavanje in pretvorbo zunanjih signalov, torej bioaminov, v znotrajcelične transkripcijske faktorje, v našem primeru H2O2. Pretvorba bioaminov je odvisna od aktivnosti diamin oksidaze (rDAO; angl. rat diamin oxidase). 
Z višjimi koncentracijami rDAO se izboljša pretvorba diamina v H2O2 to pa zviša izražanje RFP. rDAO vsebuje disulfidno vez, ki se v citoplazmi prokariontov zaradi reducirajočega okolja ne more sintetizirati. Zato je študentska skupina s pomočjo sistemov DsbA-DsbB in DsbC-DsbD omogočila sintezo disulfidnih vezi v periplazmi. DsbA protein oksidira SH skupine cisteina in tvori disulfidne vezi. DsbB reciklira reduciran DsbA nazaj v aktivno oksidirano stanje. DsbC-DsbD sistem z izomerizacijo popravi nepravilno sintezo disulfidnih vezi. Hipotetično bi translokacijska oznaka na rDAO le-tega prenesla v periplazmo in s tem povečala hitrost reakcije [1].

===Element za procesiranje signala in izstopni signal===
Zazna H2O2 in glede na njegovo prisotnost ali odsotnost omogoči ustrezen kolorimetričen signal. 
Prisoten H2O2 oksidira transkripcijski faktor E. coli OxyR. Oksidiran transkripcijski faktor aktivira inducibilni promotor katG, transkripcija TEV proteaze se lahko začne [1]. 
TEV proteaza je visoko specifična cisteinska proteaza, ki lahko s proteolitično cepitvijo na cepitvenem mestu ENLYFQ posttranslacijsko modificira proteine. Cepi med glicinom in serinom ter izvira iz virusa tobačnega jedkanja (angl. Tobacco etch virus) [2]. 
RFP je označen s proti virusno SsrA C-terminalno oznako LVA. To oznako prepoznata in razgradita proteazi ClpXP ter ClpAP, ki sta endogeni proteazi v citoplazmi E. Coli.  
V primeru nizke koncentracije bioaminov se TEV proteaza ne izraža. Ker ni prisotne katalitične aktivnosti, oznaka LVA ostane na C-koncu modificiranega RFP in se razgradi s proteazama ClpXP in ClpAP. Zaradi razgradnje reporterja se rdeča barva ne izrazi. 
Pri visoki koncentraciji bioaminov se zaradi oksidacije transkripcijskega faktorja proteaza TEV izrazi in cepi oznako LVA iz modificiranega RFP. Proteazi ClpXP in ClpAP ne moreta razgraditi RFP in rdeča barva se lahko izrazi [1]. 

==Razgradnja GFP==
Konstitutivno izražanje GFP je potrebno za dokazovanje, da sistem deluje in se proteini v brez celičnem okolju lahko izražajo. Modificiran GFP je stabilen tako dolgo, dokler je na C-končnem delu prisotnih 77 aminokislin mRFP, ki ščitijo oznako LVA pred proteazami ClpXP in ClpAP. Hkratno izražanje dveh barv (rdeče in zelene) ob pozitivnem rezultatu pa lahko povzroča probleme pri odčitavanju rezultatov. Za rešitev tega problema se je študentska skupina odločila razgraditi GFP ob prisotnosti RFP.  
Pri nizki koncentraciji bioaminov se TEV proteaza ne izraža. Inhibitorna sekvenca ščiti oznako LVA in stabilizira GFP, da se lahko izrazi. 
Pri visokih koncentracijah se TEV proteaza izrazi in cepi inhibitorno sekvenco. Ker je oznaka LVA izpostavljena jo proteazi ClpXP in ClpAp lahko cepita, GFP pa se razgradi [1]. 
 
==Prototip==
Fisherly prototip je sestavljen iz treh glavnih komponent:
-palčka za vzorčenje,
-posodica za procesiranje vzorca,
-brez celični biosenzor.
V kompletu je priložena tudi vrečka za pravilno zbiranje odpadkov. Palčka za vzorčenje je narejena tako, da ima v ročaju shranjenih 50 μL MQ vode, ki se ob prelomu zgornjega dela palčke sprosti na konico. 
Po odvzemu vzorca, se posodici z ekstrakcijskim pufrom (0,01M HCl, 700 μL ) odvije zgornji pokrov in palčko vstavimo v posodico. Spodnji del posodice je prekrit z drugim pokrovčkom, ki se lahko odstrani.
S stiskom posodice se njena tekočina sprosti na biosenzor, ki se nahaja v spodnjem pokrovčku. Za analizo je potrebna ena kapljica (50 μL) vzorca. Senzor se ob stiku s tekočino hidrira. Rezultate se odčita po 23 minutah. Riba je varna za konzumiranje, če je vidna zelena barva, ki hkrati služi kot pozitivna kontrola. Rdeča barva pomeni previsoko koncentracijo bioaminov (>0,1%). Če se barva biosenzorja ne spremeni v rdečo ali zeleno je test neveljaven. Test Fisherly bi bil na voljo za 45,7 HKD, kar je 5,24 EUR. Test je potrebno hraniti pri 4℃ in porabiti v 90 dneh. 
Pred sestavitvijo celotnega brez celičnega sistema je študentska ekipa s štirimi eksperimenti raziskala genske interakcije. Testirali so rDAO, dva OxyR inducibilna promotorja, cepitev oznake LVA iz RFP, povezavo med ekspresijo proteaze TEV in cepitvijo inhibitorne sekvence na GFP [1]. 

===rDAO aktivnost===
Za eksperiment so potrebovali nukleotidni zapis za rDAO označen s sekvenco PelB (aminokislinsko zaporedje, ki usmerja protein v periplazmo bakterije), nukleotidni zapis rDAO in vektor pSB1C3 za negativno kontrolo.
V eksperimentu so za določanje aktivnosti encima uporabili ninhidrin, ki ob reakciji z diamini sintetizira barven produkt, katerega absorbanco lahko merimo pri 570 nm. Jakost absorbance je premo sorazmerna s koncentracijo diamina. Ob delovanju rDAO bo koncentracija diamina zaradi pretvorbe v H2O2 padala. Večja kot bo aktivnost rDAO, večji bo padec absorbance. Z eksperimentom so dokazali, da ima pelB-rDAO višjo aktivnost, kot rDAO brez aminokislinskega zaporedja [1]. 

===Analiza inducibilnih promotorjev OxyS in KatG===
Inducibilna pormotorja OxyS in KatG, ki nadzirata izražanje oxyR gena, sta lokalizirana navzgor od zapisa za GFP in RFP. 
Konstrukti za eksperiment:
-oxySp-GFP-Pc-OxyR in katGp-RFP-Pc-OxyR,
-pozitivna kontrola: Pc-OxyR, oxySp-GFP in katGp-RFP,
-negativna kontrola: pSB1C3.
Eksperiment je pokazal, da je za sintezo GFP je potrebna manjša koncentracija H2O2 kot za sintezo RFP, saj se OxySp odziva na nižje koncentracije H2O2 [1].

===Povezava med izražanjem proteaze TEV in cepitvijo oznake LVA iz RFP===
Oznako LVA lahko iz RFP cepita proteazi ClpXP in ClpAP. Ob cepitvi se RFP stabilizira in poveča izražanje rdeče barve. Z eksperimentom so dokazali uspešno cepitev oznake iz RFP.
Konstrukti, ki so jih uporabili v eksperimentu so:
-Ptac - TEV - Pc - RFP – LVA,
-Ptac - TEV - Pc - RFP – LVA,
-pozitivna kontrola: Ptac - TEV - Pc – RFP,
-negativna kontrola: pSB1C3 [1].<br />

===Povezava med izražanjem proteaze TEV in cepitvijo inhibitorne sekvence na koncu oznake LVA na GFP===
S tem eksperimentom so hoteli analizirati povezavo med izražanjem TEV proteaze in cepitvijo inhibitorne sekvence. Slednja se nahaja na koncu oznake LVA in jo ščiti pred razgradnjo s proteazami ClpXP ter ClpAP. S tem se stabilizira GFP in omogoči njegovo razgradnjo samo ob prisotnosti proteaze TEV. Konstrukt brez inhibitorne sekvence povzroči konstitutivno razgradnjo GFP [1].

==Brez celični sistem==
Prednosti brez celičnega sistema so nadzorovana transkripcija, translacija, posttranslacijske modifikacije in izražanje rekombinantnih genov [3]. V brez celičnem sistemu je ključnega pomena citoplazemski ekstrakt, ki vsebuje pomembne komponente potrebne za transkripcijo in translacijo. Sistem Fisherly temelji na citoplazemskem ekstraktu E. coli (sev BL21), ki so ga pridobili s sonifikacijo. Prav tako pomemben faktor za delujoč brez celični sistem je reakcijska mešanica, saj zagotavlja zalogo Mg, PEG (polietilen glikol), ATP, 3-PGA (3-fosfo-glicerat), aminokislin in tRNA. Vodo so iz sistema odstranili z liofilizacijo (sušenje z zamrzovanjem) [1]. 

==Viri==
[1] FISHERLY https://2022.igem.wiki/hkust/.<br />   
[2] Raran-Kurussi S., Cherry S., Zhang D. et al. Removal of Affinity Tags with TEV Protease. Methods Mol Biol. 2017. doi: 10.1007/978-1-4939-6887-9_14.<br />
[3] Yang J., Cui Y., Cao Z. et al. Strategy exploration for developing robust lyophilized cell-free systems. Biotechnology Notes. 2021. doi: 10.1016/j.biotno.2021.08.004.