View source for Gene overexpression

== '''β-Glucan Synthase Gene Overexpression and β-Glucans Overproduction in ''Pleurotus ostreatus'' Using Promoter Swapping''' ==


'''UVOD'''

β-glukani so glavne strukturne komponente glivnih celičnih sten. Delujejo kot antioksidanti, uporabljajo pa se tudi kot imunološki stimulatorji zaradi antitumorskega, antibakterijskega, antivirusnega, antihiperholesterolemičnega, antidiabetičnega efekta in lovljenja prostih radikalov. Produkcija glivnih β-glukanov po naravi zelo nizka, zato se za izboljšanje uporablja genetski inženiring. Za sintezo glivnih β-glukanov je odgovorna β-1,3-glukan sintaza (GLS). GLS kompleks je sestavljen iz katalitične (FKS) in regulatorne podenote (RHO). V glivnih genomih sta FKS in RHO zelo ohranjena in imata ponavadi samo kopijo ali dve v celici. ''Pleurotus ostreatus'' je uporabna zaradi velike prilagodljivosti, produktivnosti in kratkega časa rasti. V tej študiji so s homologno rekominacijo so zamenjali promoter za gen GLS iz P. ostreatus za promoter za gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo (Pgpd) iz ''Aspergillus nidulans''.


'''MATERIALI IN METODE'''

Homologni rekombinantni fragment (HRF) za zamenjavo promoterja za GLS so sestavili iz petih DNA segmentov: UH, Pgpd 1035, hph, Pgpd in GLS 1025. 1015 bp dolga upstream homologna sekvenca UH je odgovarjala 3΄ koncu delne sekvence za promoter za GLS. 1035 bp dolg Pgdb 1035 je služil kot upstream FLP prepoznavna regija. To je promoter gena gpd  iz ''Aspergillus nidulans''. 2822 bp dolgo zaporedje hph je zapis za higromicin B iz ekspresijske kasete E. coli in je predstavljalo selektivni marker. 2206 bp dolgo zaporedje Pgpd so pomnožili s pomočjo plazmida pAN7-1. 1025 bp dolga downstream homologna sekvenca GLS 1025 se je vezala na 5΄konec delne sekvence ''P. ostreatus'' GLS. 


TD-OE PCR

Za fuzijo petih DNA segmentov, ki so tvorili HRF, so izvedli dva cikla kombiniranega touchdown in prekrivnega PCR. V prvem delu so izvedli fuzijo treh segmentov: hph, Pgpd, in GLS 1025. Nastal je dolg fuzijski segment hPG. V drugem delu TD-OE PCR so izvedli fuzijo ostalih treh DNA segmentov: UH, Pgpd 1035 in prej pridobljenega hPG. 
Značilno za touchdown PCR je, da se temperatura naleganja primerjev postopno znižuje v naslednjih ciklih. Temperatura začetnih ciklov je 3-5˚C višja od Tm uporabljenih primerjev, kasneje se zniža za ravno toliko napram Tm. Višja začetna temperatura naleganja omogoča večjo specifičnost za vezanje, medtem ko se z nižanjem temperature poveča učinkovitost podaljševanja. 


TRANSFORMACIJA GLIVNEGA PROTOPLASTA ''P. ostreatus'' TD 300 Z HRF, POSREDOVANA Z PEG/CaCl2

Protoplaste ''P. ostreatus'' TD 300 so suspendirali v MTC pufru. 100μl suspenzije so zmešali z 10μg DNA fragmenta. Transformante so gojili na gojišču PDA z in brez dodatka higromicina B. Za preveritev zamenjave promoterja za GLS z narejenim HRF so uporabili dve PCR reakcijski mešanici z genomsko DNA transformant kot predlogo. 


SEMIKVANTITATIVNI RT-PCR

Za analizo izražanja GLS v transformantah so uporabili semikvanitativni RT-PCR z manjšimi odstopanji. Celotno RNA so izolirali iz transformant. Za reverzno transkripcijo in amplifikacijo GLS so uporabili primerje GLS-F in GLS-R, za reverzno transkripcijo in amplifikacijo gospodinjskega gena β-aktina pa so uporabili primerje AC-1 in AC-2. 


ANALIZA VSEBINE β-GLUKANA IN INFRARDEČI SPEKTER

Vsebnost polisaharidov (β-glukanov) so določevali z fenol-žveplovo kislinsko metodo, značilnosti pa karakterizirali z infrardečo spektroskopijo.


'''REZULTATI'''

DNA segmenti HRF so se uspešno zlepili skupaj, njegova velikost je obsegala 8103 bp. Samo integracijo in zamenjavo promoterjev so preverili s PCR. Naključno so izbrali šest transformant. Pričakovane pomnožitve PCR so pridobili iz druge generacije in iz pete generacije transformant. Rezultat je pokazal, da se je hph gen v HRF zbrisal v tretji generaciji. Predstavljeni Pgpd je zamenjal GLS promoter in ostal genetsko stabilen. Z RT PCR so ugotovili, da je izražanje GLS dva do štirikrat večje kot pri divjem tipu. Polisaharidni donos šestih transformant je bil ocenjen na 32% do 131% višji kot pri divjem tipu.


'''ZAKLJUČEK'''

Glavna strategija za metabolni inženiring je inženiring promoterjev. Obsega spreminjanje promoterjev za čim večjo ekspresijo ključnih genov. Uspešno se uporablja pri bakterijah in glivah. Pgpd je konstitutivni promoter, ki ga uporabljajo za različne glivne vrste in zagotavlja visoko raven konstitutivnega izražanja genov. Za izgradnjo HRF je potrebna fuzija petih do šestih DNA segmentov. Fuzije večih segmentov ponavadi izvajamo z OE PCR, vendar ta ne zmore zliti skupaj več kot dveh segmentov hkrati. V tej študiji so uporabili kombinirani metodi PCR (TD in OE) samo v dveh ciklih za fuzijo petih segmentov fragmenta, kar jim je omogočilo narediti HRF za zamenjavo GLS promoterja brez prilagoditve temperature naleganja primerjev.