View source for Genetsko kodirani biosenzor za spremljanje depolimerizacije morskih polisarahidov

Izhodiščni članek: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41612076/

==Uvod==
Z višanjem temperature okolja in odlaganjem hranilnih snovi v morske vode, se v zadnjih desetletjih zlasti ribiški in turistični sektor soočata s težavo nekontroliranega cvetenja alg. Velik izziv predstavlja hitra rast makroalg iz rodu ''Ulva'', ki zaradi izpostavljenosti tokovom izgubijo stik s podlago in se začnejo nabirati na obalah. Makroalge ''Ulva'' so obdane s celično steno, njihov glavni gradnik je polisaharid ulvan, ki predstavlja kar 30% suhe mase organizma [1, 2].

Ulvan je polisaharid kompleksne sestave, ki se med posameznimi vrstami rodu ''Ulva'' zelo razlikuje. V glavnem je zgrajen iz monosaharida L-ramnoze 3-sulfata (Rha3S, 49% molskega deleža), ki se poveže z D-glukuronsko kislino (GlcA, 23,8% molskega deleža) preko β-1,4 vezi. Namesto D-glukuronske kisline je lahko na L-ramnozo 3-sulfat vezana tudi L-iduronska kislina (IdoA) preko α-1,4 vezi ali ksiloza (Xyl) preko β-1,4 vezi. Glavna veriga se preko L-ramnoze 3-sulfata povezuje v kompleksno strukturo. Deleži različnih sladkorjev, ki so vezani na  L-ramnozo se močno razlikujejo med posameznim vrstami v rodu ''Ulva'' [3].

Zaradi velikih količin alg, ki jih redno odstranjujejo z obal je zato postal ulvan iz celične stene makroalg rodu ''Ulva'' pomemben vir monosaharidov. Veliki porabniki L-ramnoze na industrijskem nivoju so tako živilska kot tudi farmacevtska, kozmetična in gradbena industrija [4, 5]. Razgradnja polisaharidov celilčne stene alg zato predstavlja veliko globalno prednost pred industrijsko sintezo L-ramnoze, saj odstranjevanje odpadne biomase iz morja ni več strošek, temveč vir dragocenih surovin.

==Zasnova ideje biosenzorja==
Spremljanje razgradnje ulvana do končnega monosaharida L-ramnoze je torej postalo ključnega pomena za nadaljno industrijsko uporabo le-tega. Dosedanje tehnike so temeljile na kromatografskih metodah, preko katerih so kvantificirali razgradne produkte ob dodajanju ulvanolitičnih encimov polisaharidu. Tehnika analize je zaznavala spreminjanje koncentracije redukcijskih koncev, ki nastanejo ob cepitvi glikozidne vezi v polisaharidu. Preko vezave reagentov na redukcijske konce je prišlo do spremembe barve, s pomočjo katere so lahko sledili razgradnji ulvana na manjše sladkorne enote. Uporabljene kromatografske metode niso specifične, saj ne nudijo informacij o velikosti in identiteti nastalih sladkornih enot [1].

Za razgradnjo kompleksnega polisaharida ulvana, so nekateri morski mikroorganizmi razvili ulvanolitične encime, s katerimi lahko dobljene monosaharide uporabijo kot vir energije. Primer takega organizma je morska bakterija ''Formosa Agariphila'', ki nosi zapis za te proteine v regijah PUL (»polisaharide utilisation loci«) v svojem genomu. Pri izboljšavi detekcije razgradnje ulvana so Wolf in sod. uporabili ulvanolitične encime iz ''F. Agariphila''. Biosenzor, ki je detektiral prisotnost L-ramnoze v mešanici pa je temeljil na sistemu, ki ga uporabljajo bakterije ''Escherichia Coli'' pri regulaciji metabolizma ramnoze. Plazmid, ki so ga znanstveniki uporablili, je poleg zapisov za proteine, ki se odzivajo na prisotnost L-ramnoze v celici, vseboval izboljšano obliko zelenega fluorescentnega proteina, sfGFP (»superfolded green fluorescent protein«). Ta je ob prisotnosti proste L-ramnoze deloval kot reporterski gen [1].

===Regulacija presnove ramnoze pri ''E. Coli''===
Pri ''E. Coli'' sta ključna aktivatorska proteina RhaR in RhaS. RhaR je protein, ki se konstitutivno izraža in ob prisotnosti L-ramnoze deluje kot transkripcijski faktor za prepisovanje zapisa za protein RhaS. Ob prisotnosti obeh transkripcijskih aktivatorjev, RhaR in RhaS, pride do vezave RNA polimeraze na promotor P<sub>rha</sub>BAD in posledično izražanja genov, ki so odgovorni za presnovo ramnoze v celici [6]. Študije so pokazale, da je tudi ob prisotnosti samega proteina RhaS možna vezava RNA polimeraze na promotor P<sub>rha</sub>BAD [7].

Promotor P<sub>rha</sub>BAD, v nasprotju s promotorji kakršna sta npr. P<sub>lac</sub> ali P<sub>ara</sub>BAD, ki delujeta po načelu »vse ali nič«, deluje sorazmerno s koncentracijo ramnoze v celici. Ob višji koncentraciji ramnoze je torej izražanje genov, ki se nahajajo navzdol od tega promotorja, močnejše [1].

==Zgradba in delovanje biosenzorja==
Pri ustvarjanju biosenzorja za detekcijo razgradnje ulvana pri makroalgah, je bila ključnega pomena specifičnost zaznave in uporaba učinkovitega reporterskega sistema, ki bi omogočal detekcijo tudi pri nizkih koncentracijah. Zaradi tega je bila izbira sistema za regulacijo presnove ramnoze iz ''E. Coli'' najprimernejša, kjer izražanje reporterskega proteina sfGFP sorazmerno narašča z naraščajočo koncentracijo ramnoze v celici [1]. 
===Konstrukti za razgradnjo ulvana===
Wolf in sod. so za učinkovito razgradnjo ulvana uporabili encime, ki so zapisani v genomu bakterije ''F. Agariphila'' v regiji PUL-H. Zapise za encime so vstavili v plazmid pET28a, ki vsebuje gen za odpornost proti kanamicinu, T7 promotor, za njim laktonski operon in multiplo klonirno mesto. Plazmid vsebuje tudi zapis za represor LacI, ki se veže na P<sub>lac</sub>, ko laktoze oz. njenih analogov ni v celici. Zapise za želene encime P10_PL40, P24_GH3, P31_GH39, P32_S1_8, P33_GH105 in P36_S1_25 so vnesli za laktonskim operonom. Vsi izraženi ulvanolitični encimi so vsebovali tudi N-končno 6xHis oznako.

* P10_PL40: Ulvan liaza katalizira cepitev glikozidne vezi med GlcA ali IdoA in Rha3S. Nastane nenasičena uronska kislina na nereducirajočem koncu.
* P24_GH3: Glikozid hidrolaza hidrolizira vez med Xyl in Rha3S. Nastane Xyl-Rha3S-intermediat.
* P31_GH39: Ksilozidaza katalizira cepitev med Xyl in Rha3S in sprosti Xyl-Rha3S disaharid. 
* P32_S1_8: Sulfataza odstrani eno sulfatno skupino iz sulfatirane ksiloze Xyl2S. Encim je potreben, ko je v polisaharidu sulfatirana tudi ksiloza, saj jo pripravi za naknadno cepitev glikozidne vezi.  
*P33_GH105: Nenasičena glukuronil hidrolaza sprosti Rha3S iz produkta, ki ga je ustvarila ulvan liaza.
* P36_S1_25: Sulfataza odstrani sulfatne skupine iz Rha3S in sprosti L-ramnozo.

Rekombinantne proteine so izražali v celicah ''E. Coli'' seva BL21(DE3), saj ta sev izraža RNA polimerazo T7, ki omogoča izražanje genov v multiplem klonirnem mestu na plazmidu pET28a. Selekcijo celic, ki so uspešno sprejele plazmid, so izvedli z dodatkom kanamicina v gojišče. Izražanje encimov so inducirali z dodajanjem IPTG. Lizate celic so nanesli na kolono za Ni<sup>2+</sup> afinitetno kromatografijo in zbirali frakcije eluiranih encimov. Izolirani encimi so bili tako pripravljeni za razgradnjo ulvana [1].

===Detekcija proste L-ramnoze===
Za pripravo konstrukta za detekcijo proste L-ramnoze so uporabili plazmid pCK302. Ta plazmid nosi zapis za odpornost proti ampicilinu, zapis za transkripcijski faktor RhaS z lastnim vezavnim mestom za ribosom (RBS), promotor P<sub>rha</sub>BAD in navzdol od promotorja zapis za reporterski protein sfGFP, ki vsebuje sintetični RBS. 

Plazmid pCK302 so s transformacijo vnesli v celice ''E. Coli'' seva BL21(DE3). Selekcijo celic, ki so uspešno sprejele plazmid, so izvedli z dodatkom ampicilina v gojišče. 

===Analiza učinkovitosti biosenzorja in nadaljne modifikacije===
Analizo fluorescence oz. učinkovitosti biosenzorja so izvedli s primerjavo intenzitet fluorescence standardnih vzorcev L-ramnoze in vzorcev po razgradnji biomase makroalg rodu ''Ulva'' z ulvanolitičnimi encimi, ki so jih pred tem izolirali [1]. 

V zapis za sfGFP so uvedli T7g10 sl zanko, ki izhaja iz kapsidnega proteina faga T7 in poveča stabilnost 5' konca mRNA, saj prepreči razgradnjo z nukleazami. Plazmid, ki je v zapisu za sfGFP vseboval zanko T7g10 sl zanko je bil pCK302sl [8, 9]. Z uvedbo zanke so opazili dvakratno intenziteto fluorescence pri raztopinah L-ramnoze v razponu koncentracij 10μM – 1mM v primerjavi s fluorescenco, ki so jo opazili pri originalnem plazmidu pCK302 [1].  

Uvedli so tudi dve mutaciji v vezavni mesti za RhaS na promotorju P<sub>rha</sub>BAD. Mutaciji, ki sta ju vsebovala plazmid pCK302sl_bind1 in plazmid pCK302sl_bind2, nista pokazali znatne razlike v fluorescenci v primerjavi s samo uvedbo T7g10 sl zanke [1].
 
Poleg uvedbe mutacij so v plazmid pCK302 namesto zapisa za sfGFP vnesli zapise za tri različne reporterske proteine: ojačani zeleni fluorescenčni protein eGFP, monomerni zeleni fluorescentni protein mStayGold in mCherry. Pri enakem razponu koncentracij L-ramnoze je največjo intenziteto fluorescence pokazal sfGFP [1].

==Zaključek==
Razvoj genetsko kodiranega biosenzorja, ki so ga zasnovali Worth in sod., pomeni pomemben mejnik pri spremljanju procesa razgradnje ulvana. Z uporabo regulacijskega sistema bakterije ‘’E. Coli’’ in fluorescentnega reporterskega proteina je raziskovalcem uspelo ustvariti orodje, ki presega omejitve klasičnih kromatografskih metod. Glavne prednosti tega sistema so visoka specifičnost, saj biosenzor se odziva neposredno na prisotnost proste L-ramnoze, kar omogoča natančno sledenje stopnji depolimerizacije ulvana in občutljivosti, saj z uvedbo strukturnih modifikacij, kot je zanka T7g10 sl, se je občutljivost senzorja podvojila, kar omogoča zaznavo v mikromolarnih razponih že pri zelo nizkih koncentracijah monosaharida (od 10 μM navzgor) [1, 10].

==Viri==
#	Y. L. Wolf, T. Bayer, U. T. Bornscheuer: A genetically encoded L-rhamnose biosensor for monitoring marine polysaccharide depolymerization. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2026, 110, 50. DOI: 10.1007/s00253-026-13724-1
#L. Reisky, A. Préchoux, M.-K. Zühlke, M. Bäumgen, C. S. Robb, N. Gerlach, T. Roret, C. Stanetty, R. Larocque, G. Michel, idr.: A marine bacterial enzymatic cascade degrades the algal polysaccharide ulvan. Nat. Chem. Biol. 2019, 15, 803–812. DOI: 10.1038/s41589-019-0311-9
#A. S. Jagtap, C. S. Manohar: Overview on Microbial Enzymatic Production of Algal Oligosaccharides for Nutraceutical Applications. Mar. Biotechnol. 2021, 23, 159–176. DOI: 10.1007/s10126-021-10027-6
#K. Slámová, J. Kapešová, K. Valentová: “Sweet Flavonoids”: Glycosidase-Catalyzed Modifications. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 2126. DOI: 10.3390/ijms19072126
#V. Kaur, M. B. Bera, P. S. Panesar, H. Kumar, J. F. Kennedy: Welan gum: Microbial production, characterization, and applications. Int. J. Biol. Macromol. 2014, 65, 454–461. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2014.01.061
#S. M. Egan, R. F. Schleif: A Regulatory Cascade in the Induction of rhaBAD. J. Mol. Biol. 1993, 234, 87–98. DOI: 10.1006/jmbi.1993.1565
#J. R. Wickstrum, J. M. Skredenske, A. Kolin, D. J. Jin, J. Fang, S. M. Egan: Transcription Activation by the DNA-Binding Domain of the AraC Family Protein RhaS in the Absence of Its Effector-Binding Domain. J. Bacteriol. 2007, 189, 4984–4993. DOI: 10.1128/JB.00530-07
#N. Miertens, E. Remaut, W. Fiers: Increased Stability of Phage T 7g10 mRNA Is Mediated by either a 5’- or a 3’-Terminal Stem-Loop Structure. Biol. Chem. Hoppe. Seyler 1996, 377, 811–818. DOI: 10.1515/bchm3.1996.377.12.811
#A. Wegerer, T. Sun, J. Altenbuchner: Optimization of an E. coli L-rhamnose-inducible expression vector: test of various genetic module combinations. BMC Biotechnol. 2008, 8, 2. DOI: 10.1186/1472-6750-8-2
#C. L. Kelly, Z. Liu, A. Yoshihara, S. F. Jenkinson, M. R. Wormald, J. Otero, A. Estévez, A. Kato, M. H. S. Marqvorsen, G. W. J. Fleet, idr.: Synthetic Chemical Inducers and Genetic Decoupling Enable Orthogonal Control of the rhaBAD Promoter. ACS Synth. Biol. 2016, 5, 1136–1145. DOI: 10.1021/acssynbio.6b00030