View source for H-NS kot regulator transkripcije in strukture bakterijskega kromatina

=Uvod=
Bakterijski kromosom se obnaša kot pameten polimer, ki spreminja svojo tridimenzionalno obliko glede na njegovo okolje. Na 3D obliko najbolj vplivajo fizikalno-kemični dejavniki kot so osmolarnost, pH in temperature, kot tudi post-translacijske modifikacije. Arhitektura kromosoma omogoča natančno napovedovanje aktivnih genomskih procesov transkripcije in replikacije. Pomembno vlogo imajo nukleotidni proteini kot so H-NS in IHF. Povzele smo mehanizme regulacije in prehod med dvema oblikama H-NS: mostovi in filamenti, kar je prikazano na primeru operona proVWX. Obravnavale smo tudi vlogo IHF, ki stabilizira H-NS mostove in dodatno prispeva k organizaciji DNA. Osredotočile smo se tudi na topološke vplive, kjer transkripcija povzroča lokalno super-zvitje DNA. Pojasnile smo tudi kako torzijski stres vpliva na stabilnost H-NS kompleksov in omogoča aktivacijo genov, kar smo prikazale s primerom regulatorja hilD v bakteriji ''Salmonella enterica''. 

=Vpliv H-NS na strukturo bakterijskega genoma=
==Organiziranost bakterijskega genoma==
Bakterijski genom se ne nahaja v prosti oblike, temveč je organiziran v različno velike regije. Največja regija imenovana CID oz. Chromosome interaction domain je velika med deset do nekaj sto kbp. Za te domene je značilna visoka frekvenca interakciji znotraj same domene in nizka frekvenca interakciji med zunanjimi domenami. CID regije omejujejo dolgi velikokrat prepisujoči geni, ki ustvarijo območja brez plectonemov. CID regije so zelo pomembne, saj delujejo kot regulacijske enote. Geni znotraj iste CID enote so pogosto podvrženi koordinirani regulaciji in imajo podobne profile izražanja. Kljub temu so CID regije dinamične strukture, ki se spreminjajo glede na celični cikel in metabolično stanje celice, kar omogoča hitro prilagajanje bakterije na okolijske spremembe. 
Bakterijski genom je organiziran tudi v TID oz. transcription-induced domains, ki so dolge nekje do 25kbp. Te regije ločujejo dolge regije DNA z nizko stopnjo prepisovanja. Najmanjša izmed vseh domen pa so bundled domains, ki so dolge od 1-20kbp. Te regije imajo visoko stopnjo interakciji, ki so posledica super-zvitja zaradi prepisovanja. 

==H-NS kot najpomembnejši NAP==
Za vzdrževanje komplekse arhitekture in regulacijo dostopa do DNA so pomembni nukleotidni proteini (NAPs). Med najpomembnejše sodi H-NS (angl. Histone-like nucleoid-structuring protein). Osnova interakcije DNA  in H-NS je visoka afiniteta H-NS do regij, ki so bogate z adeninom in timinom (AT-bogate regije). Protein ne prepozna le posameznega zaporedja, temveč tudi širino malega žleba in intrinzično ukrivljenost dvojne vijačnice. S svojo vezavo utiša tuje gene in omogoča nadzor nad regulacijo v stresnih pogojih. 

==Oligomerizacija in dimerizacija H-NS==
Molekularna struktrua H-NS je ključna za njegovo vsestranskost pri interakciji z DNA. Protein sestavljata dve domeni, povezani z prilagodljivim veznim členom. N-terminalna domena, ki je odgovorna za tvorbo dimerov in povezovanje v oligomere in C-terminalna domena, ki omogoča neposredno vezavo na DNA. Proces oligomerizacije omogoča H-NS, da se širi vzdolž molekule DNA in tvori nukleoproteinske filamente. Način interakcije je močno odvisen od okolijskih pogojev predvsem koncentracije dvovalentnih kationov in pH vrednosti. En način lahko imenujemo linarano utrjevanje, saj se dimer H-NS veže na eno verigo DNA, potem pa poteče oligoemrizacija, kar povzroči nastanek togi palici podobne strukture DNA. Drugi bolj kompleksnejši način premoščanje (bridging mode), pa oligomer H-NS poveže dve prostorsko ločeni verigi DNA, kar vodi v nastanek zank in lasnic. 

=Molekularni mehanizmi regulacije transkripcije s H-NS=
Protein H-NS vpliva na lokalno strukturo bakterijskega kromatina in s tem na regulacijo transkripcije. Mehanizem njegovega delovanja je dobro ponazorjen na primeru operona ''proVWX'', kjer H-NS uravnava izražanje strukturnih genov v odzivu na spremembe v osmolarnosti.
==Funkcija in struktura operona ''proVWX''==
Operon ''proVWX'' (oz. ''proU''), prisoten v bakteriji ''E. coli'', se aktivira ob hiperosmotskem stresu. Njegovi strukturni geni namreč kodirajo podenote membranskega transportnega kompleksa ProU, ki omogoča vnos osmoprotektantov v celico in s tem znižanje osmotskega potenciala citoplazme. 

Operon je sestavljen iz več elementov, ki si v genomu sledijo v naslednjem zaporedju: URE (angl. Upstream Regulatory Element), promotor P2, DRE (angl. Downstream Regulatory Element) ter nazadnje strukturni geni ''proV'', ''proW'' in ''proX''. Genu ''proX'' sledi tudi gen ''ygaY'', ki sicer ni del operona, vendar ima pomembno vlogo pri interakciji z DRE in organizaciji kromatina.

==Vloga H-NS mostov pri regulaciji transkripcije==
Struktura H-NS in s tem njegov vpliv na organizacijo DNA znotraj operona sta odvisna od osmolarnosti. Pri nizki osmolarnosti H-NS tvori dva funkcionalno različna mostova: URE:H-NS:DRE in DRE:H-NS:''ygaY'' (slika 8a: https://doi.org/10.1038/s41467-023-43322-y). Most URE:H-NS:DRE povzroča nastanek DNA zanke, znotraj katere se nahaja promotor P2. Takšna konformacija deluje represivno, saj preprečuje vezavo RNA-polimeraze na promotor in s tem onemogoča iniciacijo transkripcije. V primeru, da je RNA-polimeraza že vezana na promotor, se ujame znotraj zanke in ne more preiti v fazo elongacije. Most DRE:H-NS:''ygaY'' pa ne vpliva neposredno na iniciacijo, lahko pa predstavlja fizično oviro za RNA-polimerazo med elongacijo.

Ob povečani osmolarnosti pa pride do konformacijske spremembe H-NS, ki zmanjša njegovo sposobnost hkratne vezave dveh DNA regij. Posledično se most URE:H-NS:DRE razgradi, H-NS pa preide v obliko filamenta, vezano bodisi na DRE bodisi na URE. S tem se zanka sprosti, promotor postane dostopen, RNA-polimeraza pa lahko začne ali nadaljuje s transkripcijo (slika 8b: https://doi.org/10.1038/s41467-023-43322-y). Med elongacijo mora RNA-polimeraza preiti tudi regijo DRE. Če filamentna oblika H-NS ostane vezana na DRE, to encimu ne preprečuje napredovanja, saj med elongacijo ustvarja mehansko silo, ki omogoča njegovo napredovanje vzdolž DNA in odstranjevanje vezanega H-NS.

Nasprotno se most DRE:H-NS:''ygaY'' ob povišani osmolarnosti ne razgradi, temveč se le delno destabilizira. Takšna oslabljena struktura pa ne predstavlja več učinkovite ovire za RNA-polimerazo, zato ta med elongacijo nemoteno prehaja skozi to regijo. Regulacija operona ''proU'' tako temelji na usklajenem, vendar diferencialnem odzivu obeh mostov na spremembe v osmolarnosti.

==Vpliv IHF na organizacijo DNA in stabilnost H-NS mostov==
Razlike v odzivu posameznih H-NS mostov na osmolarnost so verjetno posledica delovanja drugih NAP proteinov, kot je IHF. IHF se veže na specifično mesto med regijama URE in DRE ter povzroča močno upogibanje DNA z interkalacijo enega ali dveh prolinskih ostankov med bazne pare.

Pri nizki osmolarnosti IHF interkalira oba prolinska ostanka, kar vodi v tvorbo popolnoma upognjene konformacije DNA (oblika črke U) (PDB: 1IHF). S tem se regiji URE in DRE prostorsko približata, kar stabilizira most URE:H-NS:DRE.

Ob visoki osmolarnosti pa IHF interkalira le en prolinski ostanek, kar vodi v sprostitev enega kraka DNA. DNA tako zavzame delno upognjeno konformacijo (oblika črke L), razdalja med URE in DRE pa se poveča, kar dodatno destabilizira most URE:H-NS:DRE.

Nasprotno pa IHF nima pomembnega vpliva na most DRE:H-NS:''ygaY'', saj konformacija DNA med tema dvema regijama ostaja nespremenjena.

=Topološki vplivi na H-NS=

==H-NS kot strukturni represor bakterijskega kromatina==

NAP protein H-NS deluje kot globalni transkripcijski represor v bakterijah. Na DNA vijačnico se veže in tvori tako linearne oligomerne filamente kot tudi, za represijo ključne mostove . H-NS neposredno zaznava in izkorišča lokalno DNA topologijo. Preferenčno stabilizira negativno dodatno zvito DNA, kjer lahko učinkovito oligomerizira in vzpostavi mostičke. Takšni mostovi povečajo rigidnost DNA, zmanjšajo dostopnost promotorjev in otežijo lokalno odpiranje dvojne vijačnice, kar vodi v transkripcijsko represijo genov.

==Transkripcija povzroča dodatno zvitje==

Med aktivno transkripcijo pa pride do lokalnih sprememb v DNA topologiji. RNA polimeraza se veže na DNA in zaradi translokacije ter omejene rotacije v makromolekularno zasičenem okolju pride do akumulacije torzijske napetosti, kar povzroči spremembe v dodatnem zvitju. Nastaneta dve »twin supercoiling« domeni: pred encimom (downstream) se kopiči pozitivno dodatno zvitje, za encimom (upstream) pa negativno dodatno zvitje.

==Transkripcija vpliva na H-NS kompleks==

Funkcija H-NS kot represorja je neposredno odvisna od stabilnosti njegovih mostov. Ko transkripcija poveča lokalno torzijsko napetost in spremeni porazdelitev dodatnega zvitja v regiji H-NS vezave, se spremeni geometrija DNA v teh območjih. To lahko oslabi kooperativno vezavo H-NS proteinov na DNA in destabilizira mostove ter s tem kompaktno, represivno organizacijo DNA. Transkripcija lahko torej s spremembami v dodatnem zvitju remodelira kromatin, kar destabilizira H-NS interakcije, omogoči povečano dostopnost promotorjev in prekine represijo genov. Poleg destabilizacije lahko pride tudi do delne disociacije H-NS z DNA.

==Regulacijski primer: hilD v Salmonella enterica==

Primer tega vidimo pri genu hilD v Salmonella enterica. hilD kodira osrednji transkripcijski regulator otoka patogenosti SPI-1, ki nadzoruje izražanje številnih genov, povezanih z virulenco. Pod normalnimi pogoji je gen hilD represiran z H-NS, ki tvori mostove in preprečuje vezavo RNA polimeraze. Ob povečani transkripcijski aktivnosti v regiji pa lokalne spremembe v DNA topologiji oziroma spremembe v dodatnem zvitju oslabijo stabilnost H-NS kompleksa. To omogoči dostop RNA polimerazi do promotorja in vodi do aktivacije hilD. Pomembno je, da je aktivacija gena hilD pogosto učinkovitejša, kadar je transkripcija sklopljena s translacijo. Translacijski aparat namreč poveča mehanske sile na nastajajočo RNA in transkripcijski kompleks, kar dodatno prispeva k akumulaciji torzijske napetosti. Večje kopičenje dodatnega zvitja vodi v bolj učinkovito destabilizacijo H-NS mostov in zmanjšanje represije gena.
Ta mehanizem kaže, da protein H-NS ni statičen represor, ampak deluje kot dinamičen strukturni regulator bakterijskega kromatina, katerega funkcija je neposredno modulirana z lokalno DNA topologijo, ki jo med drugim ustvarja transkripcija.

=Zaključek=

H-NS je pomemben nukleoidno-asociiran protein, ki v bakterijah deluje kot globalni represor transkripcije in ključen organizator bakterijskega kromatina. Na DNA se veže v obliki oligomerov, pri čemer tvori filamente in predvsem tvorbo mostov, ki kondenzirajo DNA ter zmanjšujejo dostopnost promotorjev za RNA polimerazo. Na ta način H-NS stabilizira represivno kromatinsko strukturo in prispeva k utišanju številnih genov. Njegovo delovanje je tesno povezano z DNA topologijo, zlasti s stopnjo dodatnega zvitja, ki vpliva na stabilnost in način vezave H-NS na kromatin. Spremembe v lokalni topologiji DNA lahko vplivajo na stabilnost tvorbe mostov in s tem na učinkovitost represije.

=Viri=
* F. M. Rashid, R. T. Dame: 2024: A “nucleoid space” odyssey featuring H‐NS. BioEssays 2024, 46, 2400098. DOI: 10.1002/bies.202400098
* F.-Z. M. Rashid, F. G. E. Crémazy, A. Hofmann, D. Forrest, D. C. Grainger, D. W. Heermann, R. T. Dame: The environmentally-regulated interplay between local three-dimensional chromatin organisation and transcription of proVWX in E. coli. Nat Commun 2023, 14, 7478. DOI: 10.1038/s41467-023-43322-y
*Dorman, C. J.: DNA supercoiling and transcription in bacteria:A two-way street. BMC Molecular and Cell Biology. 2019, 20, 1–9. DOI: 10.1186/s12860-019-0210-z
*Figueroa-Bossi, N., Fernández-Fernández, R., Kerboriou, P., Bouloc, P.,Casadesús, J., Sánchez-Romero, M. A., & Bossi, L.: Transcription-driven DNA supercoiling counteracts H-NS-mediated gene silencing inbacterial chromatin. Nature Communications. 2024, 15(1), 2787. DOI: 10.1038/s41467-024-47114-w
*Winardhi R, Yan J, Kenney L, H-NS Regulates Gene Expression and Compacts the Nucleoid: Insights from Single-Molecule Experiments, Biophysical Journal, 109, 1321-1329