View source for HYPE-IT - spreminjanje genoma rastlin

iGEM 2016 ekipa Universitat Politècnica de València http://2016.igem.org/Team:Valencia_UPV
== Uvod==

iGEM ekipa Universitat Politècnica de València si je pri svojem projektu za cilj zadala izboljšanje lastnosti v prehrani uporabljenih rastlin, da bi lažje zadostili svetovnim naraščajočim potrebam po hrani. Predstavili so HYPE-IT,  prilagojen sistem CRISPR/Cas9, ki bo omogočil natančno urejanje genoma in tako uporabnikom približal potrebno tehnologijo za spreminjanje rastlinskega genoma.
Projekt HYPE-IT je bil zasnovan v dveh delih; najprej so razvili programsko orodje, ki uporabnikom omogoči načrtovanje optimalne gRNA za izbitje želenega gena v rastlini, v drugem koraku pa so pripravili sistem za preverjanje učinkovitosti gRNA v rastlini ''N. benthamiana'' preko reporterskega gena za luciferazo. Ker je lahko oprema za izvedbo tovrstnega dela zelo draga, je ekipa razvila tudi svojo laboratorijsko opremo. Potrebne komponente so združili v aluminijastem ohišju, cena tako pripravljene aparature pa je bila nižja od 1000 € oz. je znašala le 7% vrednosti komercialnih aparatur.

== Programska oprema za obdelavo podatkov ==

Programsko orodje deluje na prosto dostopnem strežniku (http://hypeit.cloudno.de/) in je ob registraciji brezplačno na voljo uporabnikom. Omogoča izbiranje med različnimi rastlinskimi vrstami, geni ali zgolj želenimi lastnostmi, ki naj bi jih uporabnikova rastlina pridobila. Preko posebnih algoritmov orodje poveže značilnost neke rastline s specifičnim tarčnim genom in načrta različne gRNA, primerne za izbitje tega gena. V primeru, da uporabnik razpolaga s svojim zaporedjem, lahko le-to v orodje vstavi v formatu FASTA ali txt in prav tako pridobi seznam potencialno uporabnih gRNA. Orodje različne gRNA točkovno ovrednoti, najbolj optimalno naj bi bilo zaporedje z največjim številom točk. Sistem točkovanja je osnovan na petih kriterijih; trije se navezujejo na sekvenco PAM, dva pa sta strukturne narave (ali predlagano zaporedje vsebuje palindromske ponovitve in ali je število gvaninov in citozinov ustrezno).
Za primerjavo uspešnosti svojih gRNA oz. algoritmov, s katerimi program računa, so zaporedje za določen gen vstavili v orodje HYPE-IT in rezultate primerjali s predlaganimi zaporedji konkurenčnih programskih orodij. gRNA , ki jih je predlagal HYPE-IT, so bile vedno med prvimi petimi zadetki tudi pri konkurenčnih orodjih, ki so delovala s svojimi algoritmi. Ker je HYPE-IT prilagojen za rastline, vsebuje nekoliko drugačen sistem točkovanja, kar naj bi pojasnilo, zakaj se najbolje ovrednotena gRNA, ni skladala z najboljšo gRNA konkurentov. 

=== Podatkovna baza ===

Ekipa HYPE-IT je v člankih poiskala gene, katerih izbitje vodi do zanimvih fenotipskih lastnosti. Izbrali so le članke, pri katerih so gene utišali z RNA interferenco ali s CRISPR/Cas9 sistemov ter pridobili funkcionalne rastline, ki so lahko obrodile plodove. Na tak način bi namreč omogočili nadaljnji razplod in pridobili rastline, v katerih genom ne bi bilo več potrebno posegati. V podatkovni bazi orodja HYPE-IT se je najprej nahajalo približno 20 genov, katerih izbitje je izboljšalo rastlinske lastnosti.  V naslednjem koraku so identificirane gene analizirali z bioinformatskim  orodjem BLAST in pridobili več kot 200 genov, ki zapisujejo za njihove homologe v številnih rastlinah. HYPE-IT podatkovna baza poleg fenotipske lastnosti vsebuje tudi pomembne z izbranim genom povezane informacije ter članek, na podlagi katerega je bil gen vključen v bazo. 

== Predviden potek dela ==

Uporabnik se prijavi v programsko orodje HYPE-IT, izbere želeno lastnost oz. vstavi zaporedje določenege gena in na podlagi izračunanih rezultatov izbere optimalno gRNA. Ker obstaja možnost, da je v podatkovni bazi orodja zaporedje, ki se razlikuje od genoma uporabnikove rastline, je priporočljivo, da se najprej preveri kompatibilnost. Uporabnik izvede ekstrakcijo DNA iz svojih rastlin, naroči začetne oligonukleotide, ki jih prav tako načrta orodje HYPE-IT, in izvede reakcijo PCR. Reakcijsko mešanico nato nanese na gel, izbere fragment ustrezne velikosti in ga pošlje na sekvenciranje. Če se zaporedje ujema z zaporedjem, vnesenim v podatkovno bazo, lahko uporabnik nadaljuje z delom. Učinkovitost gRNA lahko dodatno preveri tudi s posebnih testom učinkovitosti, ki ga je razvila ekipa. Uporabnik nato ligira zaporedje gRNA v vektor, ki vsebuje tudi zaporedje za del proteina Cas9 in z njim transformira ''E. coli''. Enak postopek uporabi tudi za drug virusni vektor, ki zapisuje za drug del proteina Cas9. Pomnožene plazmide očisti, jih vstavi v ''A. tumefaciens'' in izvede agroinfiltracijo. Nekja dni kasneje uporabnik izvede mikropropagacijo kalusov (pridobljenih iz agroinfiltriranih listov) in počaka, da zrastejo nove rastline. Le-te že imajo spremenjen genom, zato lahko pridobljena semena posadi in vzgoji nove rastline.

=== Dostava v rastline ===

Za vnos sistema CRISPR/Cas9 v rastline so uporabili bakterijo ''A. tumefaciens''. Ker je zapis za endonukleazo Cas9 dolg približno 4,2 kb, so se najprej soočili s problemom, kako zapis vstaviti v virusne vektorje, ki ne dopuščajo vnosa tako velikih insertov. Težavo so obšli z uporabo strategije, ki so jo uporabili tudi Truong in sod. Gre za princip, kjer se zaporedje za spCas9 razdeli na dva dela, ki se jima doda del inteina. Skrajšano zaporedje so tako lahko vstavili v dva virusna vektorja, intein pa nato omogoči rekontrukcijo proteina v celici. Protein Cas9 je razdeljen na mestu med Lys637 in Thr638, na njegov C-terminalni del je pripet NpuDnaE C-inteina, na N-terminalnem delu pa je fuzija z NpuDnaE N-inteinom.

=== Izbira vektorjev ===

Izbrati je bilo tudi primerne virusne vektorje za vnos v rastlino, saj lahko v nasprotnem primeru pride do fenomena, imenovanega superinfekcijska izključitev (ang. superinfection exclusion). Okužba rastline z določenim virusom onemogoči sekundarno infekcijo prej okužene celice z istim oz. tesno sorodnim virusom. Mehanizem, ki takšno odpornost omogoči je le delno razumljen. Pri projektu so uporabili vektorja virusa tobačnega mozaika (TMV) in krompirjevega virusa X (PVX), ker sta lahko oba vstopala v celice brez povzročitve zgoraj opisanega efekta.

=== Test učinkovitosti gRNA ===

Razvili so modularni sistem za testiranje učinkovitosti gRNA ''in vivo''. Gre za genetsko stikalo, ki je izklopljeno, dokler endonukleaza Cas9, ki jo vodi gRNA, v tarčnem zaporedju ne naredi dvojnega preloma. Za tarčnim zaporedjem se nahaja zapis za luciferazo, ki je izven bralnega okvirja. Pri popravljanju dvojnega preloma pride do premika bralnega okvirja in posledično lahko zaznamo bioluminiscenco.
Večina biokock, ki jih je ekipa razvila, so je osredotočala na sistem preverjanja učinkovitosti gRNA. Sestavljajo jih močan konstitutiven promotor 35s virusa tobačnega mozaika, 20 nukleotidov gena Ga20ox (gre za zaporedje, na katerega se veže Cas9), zaporedje za reporterski protein luciferazo in terminator Tnos. Biokocke so v štirih različicah, razlikujejo se v povezovalnem zaporedju, ki je vstavljeno med delom zaporedja gena Ga20ox in genom za reporterski  protein. Onemogoča neposreden stik med omenjenima zaporedjema, da se lahko luciferaza pravilno zvije. Biokocka je modularno sestavljena in del zapisa za tarčni gen je mogoče z uporabo ustreznih štrlečih koncev zamenjati z zaporedjem, ki ga želi uporabiti uporabnik. Deluje kot stikalo, kjer vnos dodatnega nukleotida pred povezovalno zaporedje povzroči premik bralnega okvirja, zaradi česar je stikalo izklopljeno; po prevajanju luciferaza ni funkcionalna, zato bioluminiscence ni mogoče zaznati. V primeru, da gRNA vodi Cas9 do ustreznega zaporedja (zaporedja za gen, ki ga želi uporabnik utišati in ga v biokocko vstavi namesto v poskusu uporabljenega  dela zaporedja za Ga20ox),pride do dvojnega preloma vijačnice, popravljalni mehanizmi pa privedjo do mutacije, zaradi katere se spremeni bralni okvir. Tako se ponovno vzpostavi pravilno prevajanje luciferaze.  Ob dodatku luciferina lahko zaznamo bioluminiscenco in potrdimo učinkovitost gRNA. Sestavili so tudi dve biokocki, ki sta nosili razdeljen zapis za endonukleazo Cas9 fuziran s C- ali N- terminalnim delom inteina. Vse biokocke so testirali v agroinfiltriranih rastlinah ''N. benthamiana''. Uspela jim je rekonstrukcija proteina Cas9 (endonukleaza je bila aktivna) in preveritev učinkovitosti gRNA, izbrali pa so tudi najboljše povezovalno zaporedje v stikalu.

== Zaključek ==

Ekipa je za svoj projekt prejela zlato medaljo in dve posebni nagradi; za najboljšo programsko opremo in laboratorijsko opremo oz. »hardware«. Uspešno so razvili programsko orodje za načrtovanje gRNA in primernih začetnih oligonukleotidov za pomnoževanje zaporedja. Učinkovistos gRNA so preverili z za v ta namen pripravljeno biokocko in potrdili delovanje reporterskega sistema. Pripravili so tudi dokaj obširno bazo podatkov o genih, ki v rastlinah zapisujejo za določene lastnosti in uporabnikom ponudili povezavo do literature, na podlagi katere so bili geni izbrani. Sestavili so posebno ogrodje, ki je vključevalo vse doma narajene aparature, potrebne za izvedbo projekta in tako izboljšali cenovno dostopnost urejanja genoma s CRISPR/Cas9 sistemom. Zaradi časovne stiske so pripravili biokocke, do izbitja gena in preveritve, ali je njihovo urejanje genoma dejansko povzročilo želeno spremembo lastnosti, pa ni prišlo. Realizacija projekta izven tekmovanja iGEM oz. v domačem okolju zaradi številnih zakonskih omejitev zaenkrat še ni mogoča.

== Viri ==

http://2016.igem.org/Team:Valencia_UPV (sneto 15.1.2017)