View source for Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc

Izhodni članek: [https://www.nature.com/articles/s41467-022-28425-2#ref-CR25 Z. Guo et al., “Engineering and exploiting synthetic allostery of NanoLuc luciferase,” Nature Communications, vol. 13, no. 1, p. 789, Dec. 2022, doi: 10.1038/s41467-022-28425-2.]

Z alosterično regulacijo lahko povečamo ali zmanjšamo aktivnost encimov. Težave povezane z inžiniringom alosteričnih proteinov so največkrat povezane z velikimi kooperativnimi strukturnimi preureditvami ob vezavi liganda. Alosterično regulirane encime lahko uporabimo pri preučevanju vpliva zdravilnih učinkovin ali pa le ti služijo kot detektorji molekul v vzorcu. Pri slednjem je potrebno kot senzorski encim uporabit takšnega, ki oddaja nek merljiv signal. Eden takšnih encimov je luciferaza, ki katalizira reakcijo nastanka bioluminescence iz ustreznega substrata [1].   

== NanoLuc luciferaza ==
NanoLuc luciferaza je majhen protein globokomorskih kozic ''Oplophagus gracilirostis'', katerega luminescenca je kar 150 krat večja kot pri tradicionalnih luciferazah [1]. Je monomerni protein sestavljen iz 174 aminokislinskih ostankov. Gre za αβ strukturo, kjer sta dve β-ploskvi antiparalelno orientirani, vsako pa gradi po pet β-trakov. Tri α-vijačnice pa se nahajajo na N-koncu proteina [1]. 

Pri pripravi biosenzorjev se uporablja krožno permutirano različica NanoLuc luciferaze, ki ji dodamo fuzijska proteina. Ta sta odgovorna za vezavo liganta, čigar prisotnost v vzorcu nas zanima. Pri proteinskih biosenzorjih gre največkrat za alternativni način alosterije, kjer se prej neaktiven in neurejen protein po vezavi liganda pravilno strukturira ter postane aktiven [1].

== Krožna permutacija ==
Permutacija pomeni prerazporeditev nekega števila elementov na isto število prostih mest. Ko govorimo o krožni permutaciji proteinov, to označuje spremembo vrstnega reda aminokislinskega zaporedja. Pri tem navadno postane N-končni del proteina bližje C-končnemu delu in obratno. Do te spremenbe lahko pride skozi evolucijo, s posttranslacijskimi modifikaciji ali z umetno inžiniranimi mutacijami. Čeprav takšen dogodek povzroči spremembo aminokislinskega zaporedja, pa ostaja tridimenzionalna struktura nespremenjena oz. je sprememba tako majhna, da le ta ne vpliva na funkcijo proteina. Krožna permutacija lahko zmajnša proteolitično procesiranje, poveča termostabilnost in katalitično aktivnost ter odpravi ali ustvari nova vezavna mesta za ligande. Krožno permutacijo lahko dosežemo z evolucijsko duplikacijo genov, cepitvijo in fuzijo, rezanjem in lepljenjem ali z mešanjem eksonov [2]. 

'''Krožno permutirana NanoLuc luciferaza:'''
NanoLuc luciferazo so modificirali tako, da so cepili zanko, ki je povezovala deveti in deseti β trak, nato pa so C-konec desetega β-traka povezali z N-koncem prvega β-traka. Linker, ki je povezoval nativni N- in C-konec, sestavlja glicin – serin bogata veriga. Tale fleksibilna zanka tako povezuje zadnji β-trak s preostankov proteina, novo nastalo luciferazo pa imenujemo cpNanoLuc luciferaza. Na novi N- in C-konec proteina so dodali ligand vezavni domeni, ki sta se med biosenzorji razlikovali. Biosenzor za rapamicin je imel na N-koncu FKBP domeno in na C-koncu FRB domeno. Ligand vezavni domeni pri biosenzorju za takrolimus sta predstavljala spojena kalcineurin A in B ter FKBP domena. Pri biosenzorju za α-amilazo so na cpNanoLuc pripeli dve VHH domeni (nanotelesci), pri biosenzorju za človeški serumski albumin pa je eno VHH domeno zamenjal fragment G proteina. Ti fuzijski domeni držita luciferazo v neaktivni obliki, ki je posledica pomanjkanja desetega β-traka. Le ta se skriva v dolgi zanki, ki je sestavljena iz starega desetega β-traka in novega linkerja [1].

==Biosenzorji luciferaze NanoLuc==

===Delovanje biosenzorja===
Ob prisotnosti liganda v vzorcu pride do pojava luminescence, ki je posledica konformacijskih sprememb in tako prehoda neaktivne luciferaze v aktivno obliko. V neaktivni obliki fuzijski domeni povečata disociacija β-traka iz β-ploskve. Ko ligand vezavni domeni vežeta ligand, se približata ena drugi ter s tem za seboj potegneta tudi novi N- in C-konec cpNanoLuc luciferaze. Pri tem se zanka zloži v β-trak in ob prisotnost substrata, encim katalizira reakcijo nastanka luminescence. Prvi takšen znan substrat je bil luciferin, pri tej raziskavi pa so kot substrat uporabili furimazin, ki je značilen substrat NanoLuc luciferaze [1].

===Strukturne spremenbe===
Mehanizem vezave liganda in spremembo konformacije so preučevali z HDX (hydrogen/deuterium - exchange) masno spektroskopijo. Z metodo so določili kateri aminokislinski ostanki v strukturi so najbolj občutljivi na dodatek liganda, z poznavanjem pozicije pa predvidevali o najbolj občutljivi domeni. Najbolj občutljivi aminokislinski ostanki so bili v ligand vezavnih domenah, zato so predvidevali, da ti dve domeni prvi spremenita konformacijo po vezavi liganda. Pri tem so predlagali, da so vzporedne poti vezave bolj verjetne kot hkratne. Vzporedno vezavo lahko opredelimo kot logična vrata ALI, medtem ko so za hkratno vezavo bolj primerna logična vrata IN z dvema, vsaj delno, neodvisnima stikaloma [1]. 

===Priprava fuzijskih proteinov===
Fuzijski bralni okvirji so bili ustvarjeni z Gibsovim načinom sestavljanja, ki omogoča združevanje več fragmentov DNA v eni sami reakciji. S pomočjo PCR reakcije so želenim DNA zapisom za proteine dodali previse, ki so nujno potrebni za Gibsovo sestavljanje. Reakcija zahteva tri encimske aktivnost in sicer eksonukleazno, DNA polimerazno in DNA ligazno aktivnost. Prednost takšne metode pred klasičnim kloniranjem z restriktazami je, da ne zahteva restrikcijskih mest ter je veliko hitrejša [3]. Takšne fuzijske fragmente, ki so nosili zapis za vezavni domeni in modificirano luciferazo, so klonirali v vektor pET28a [1]. pET vektorji so primerni za transfekcijo bakterije ''Escherichia coli'', vendar je izražanje rekombinantnih proteinov nizko. pET28a vektor vsebuje tudi zapis za T7 promotor, ki velja za zelo močnega, s tem pa je tudi izražanje proteina višje. Za pridobivanje rekombinantnih proteinov so uporabili sev BL21(DE3)RIL ''E. Coli'', ki nosi zapis za T7 polimerazo. Sev ne vsebuje zapisa za Ion proteazo in Omp proteazo zaradi česar je znižana raven degredacije proteinov v celici. Vsi rekombinantni proteini so se izrazili v citosolu, z izjemo proteinov, ki nosijo zapise za VHH domene, ki so se izrazili v periplazemskem prostoru. Proteine so nato očistii z Ni-NTA kromatografijo, kjer so se na kolono vezali polihistidinski podaljški oz. z velikostno izključitveno kromatografijo [1].

===Testi luminescence===

Vsi rekombinantni senzorji cpNanoLuc luciferaze so kazali od koncentracije odvisno povečanje luminescence. Meja detekcije je bila pri biosenzorju za rapamicin, takrolimus in α-amilazo 50 pM, pri biosenzorju za človeški serumski albumin pa 100 pM. Analizo odvisnosti luminescence od koncentracije so izvedli pri različnih koncentracijah liganda tako, da so biosenzor najprej 15 minut pri sobni temperaturi inkubirali z analitom nato pa k reakcijski mešanici dodali luciferazni substrat (furamazin) [1]. 

Kontrolni test so naredili z divjim tipom NanoLuc, kateremu so na N- in C-konec pripeli vezavni domeni za rapamicin. Prisotnost rapamicina ni imela pomembnega vpliva na aktivnost fuzijskega divjega tipa luciferaze, s čimer so potrdili, da igra krožna permutacija pomembno vlogo pri nastanku reverzibilne lokalne porušitve strukture, ki služi kot »stikalo« med aktivno in neaktivno obliko encima. 
Prav tako pa so pokazali, da prisotnost rapamicina ne povzroči oligomerizacije in protein ostaja v monomerni obliki. Biosenzorji so bili visoko specifični, saj pri inkubaciji rapamicinskega biosenzorja s takrolimusom, ki je strukturno podoben rapamicinu, ni prišlo do signala ter obratno. Prav tako so pokazali, da so ti biosenzorji obnovljivi, saj se pri spiranju liganda senzor deaktivira, pri ponovni inkubaciji pa preide v aktivno obliko [1].

===Optimizacija===
Inžinirani biosenzorji so emitirali svetlobo pri 460 nm kar je precej nižje od željenega območja med 650 nm in 800 nm. Takšno emisijsko območje so želeli doseči, zaradi rdeče barve krvi ter drugih bioloških vzorcev, ki bi lahko sicer absorbirali del emisijske svetlobe nižjih valovnih dolžin. Najbolje se je odnesel fuzijski sistem z rdečim fluorescentnim proteinom mScarlet, ki je temeljil na BRET (bioluminescenčni resonančni prenos energije) tehniki [1].

'''BRET tehnika:'''
Pri tej tehniki izkoriščamo bioluminescenco luciferaze, ki služi kot donor energije, le ta pa se prenese na akceptorski protein. Pri tem ne potrebujeno zunanjega vira svetlobe, saj luminescenco ustvari luciferaza ob prisotnosti substrata. Emisijska svetloba valovne dolžine 400 nm se prenese na fuzijski protein in ga tako vzbudi, da fluorescira svetlobo valovne dolžine značilne za ta protein, pri tem pa se poveča občutljivost detekcije. Največkrat se kot fuzijski protein uporablja GFP ali drugi fluorescenčni proteini [4].

Rdeč fluorescenčni protein so pripeli na C-konec biosenzorja za rapamicin ali pa ga vključili v sredino povezovalne zanke cLumiLuc proteina. cLumiLuc je mutirana varianta NanoLuc biosenzorja za rapamicin, ki ima emisijski vrh pri 530 nm. Z resonančnim prenosom energije so dobili dva vrhova in sicer enega pri 530 nm ter drugega pri 610 nm, kjer prvi ustreza LumiLuc, drugi pa mScarlet proteinu [1]. 

==Zaključek==
S tem so pokazali, da je za prehajanjem med aktivno in neaktivno obliko ključna krožna permutacija ter dodatek fuzijskih ligand vezavnih domen, ki destabilizirata protein v odsotnosti liganda. Prav tako so pokazali, da so različne kombinacije fuzijskih domen enako učinkovite pri detekciji s tem pa nakazali, da se lahko takšen sistem uporablja tako za detekcijo malih molekul ali proteinov ob pravilni izbiri ligand vezavnih domen. 

==Viri==
[1]	Z. Guo et al., “Engineering and exploiting synthetic allostery of NanoLuc luciferase,” Nature Communications, vol. 13, no. 1, p. 789, Dec. 2022, doi: 10.1038/s41467-022-28425-2.
[2]	S. Bliven and A. Prlić, “Circular Permutation in Proteins,” PLoS Computational Biology, vol. 8, no. 3, p. e1002445, Mar. 2012, doi: 10.1371/journal.pcbi.1002445.
[3]	D. G. Gibson, L. Young, R.-Y. Chuang, J. C. Venter, C. A. Hutchison, and H. O. Smith, “Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases,” Nature Methods, vol. 6, no. 5, pp. 343–345, May 2009, doi: 10.1038/nmeth.1318.
[4]	M. B. Robers et al., “Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET,” Nature Communications, vol. 6, no. 1, p. 10091, Dec. 2015, doi: 10.1038/ncomms10091.