View source for Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S109671762400171X?via%3Dihub Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol] 

== Uvod ==
9 od 20 proteinogenih aminokislin je esencialnih, saj jih ljudje in živali ne moremo sintetizirati sami, ampak jih moramo zaužiti s hrano. Aminokisline so pomembne tudi kot ojačevalci okusa v prehrambni industriji ter prekurzorji v farmacevtski in kozmetični. Večina proteinogenih aminokislin se industrijsko proizvaja s fermentacijo iz sladkorjev z izoliranimi encimi [1]. Zaradi velike potrebe po sladkorjih pa to v prihodnosti morda ne bo najboljši vir za proizvodnjo aminokislin. Razvoj alternativnih poti sinteze vključuje dve glavni surovini prihodnosti; CO2 (iz metanola, etilen glikola (EG) ali etanola) in plastične odpadke (npr. EG) [2].

Predhodno so znanstveniki že razvili od treoze odvisno sintezno pot asimilacije glikolaldehida (STEGA) za sintezo 2,4-dihidroksibutirata, prekurzorja Met. Med sintezo so opazili, da v manjši meri nastane tudi stranski produkt L-treonin (L-Thr) [3].

L-Thr spada v družino aminokislin, ki se sintetizirajo iz aspartata. Njegova biosinteza poteka prek β-aspartil-fosfatne poti. Na tej poti se L-aspartat, ki nastane iz oksaloacetata v Krebsovem ciklu, pretvori v homoserin. Ta se nato s homoserin kinazo in treonin sintazo (encima ThrB in ThrC) pretvori v L-Thr. Domnevali so, da se predhodno razvita STEGA povezuje s potjo biosinteze L-Thr prek transaminacije, v kateri iz intermediata 2-okso-4-hidroksibutirata (OHB) nastane homoserin [2].

Z namenom proizvodnje L-Thr so raziskovalci želeli prilagoditi STEGA tako, da bi kot glavni produkt te poti nastajal L-Thr. Ker je mogoče izhodiščni substrat glikolaldehid (GA) biokemijsko pridobiti iz metanola ali EG, to predstavlja inovativno in trajnostno alternativno obstoječemu pridobivanju L-Thr [2].

== Delo in metode ==
Za izražanje potrebnih genov za encime so konstrukte vstavili v plazmide pEXT in plazmide serije pZ z restrikcijskim kloniranjem, kasneje so dodatno uporabili tudi plazmid pACT3. Plazmide so vnesli v seve '' E. coli '' z delecijami ključnih genov v poti asimilacije L-Thr iz GA oziroma EG. Delecije so uvedli s transdukcijo s fagi, ki so imeli izbite želene gene. Selekcijo so izvedli na ploščah s kanamicinom in potrdili s PCR na osnovi kolonije. Dodatne spremembe, kot so zamenjave naravnih promotorjev in vključitev selekcijskih markerjev (odpornost na kloramfenikol), so izvedli z rekombinacijo. Pravilno vstavitev selekcijskega markerja so preverili s PCR z mestno specifičnimi začetnimi oligonukleotidi, zaporedje promotorja pa s sekvenciranjem po Sangerju [2].

== Rezulati in razprava ==

=== Testiranje delovanja od treoze odvisne sintezne poti asimilacije glikolaldehida ===
Za preverjanje možnosti sinteze L-Thr preko STEGA so razvili avksotrofni sev '' E. coli '' TW476, ki ne raste brez eksogenega Thr. Ta ne sintetizira encimov za razgradnjo GA in prav tako nima aktivne aspartat-semialdehid dehidrogenaze, ki sodeluje pri pretvorbi D-glukoze v homoserin, prekurzor L-Thr. Z dodajanjem posameznih intermediatov STEGA (D-treonat, D-treoza, GA) in vnosom ustreznih zapisov za encime so testirali, ali lahko bakterije zrastejo. Celice so gojili pri 37 °C na rotacijskem stresalniku in spektrofotometrično spremljali njihovo rast [2].

Po potrditvi, da sev TW476 ne raste v prisotnosti D-treonata, so v sev zaporedno vnesli encimske aktivnosti, potrebne za pretvorbo D-treonata v L-homoserin. Ta spojina se nato s fosforilacijo in dehidracijo znotrajcelično pretvori v L-Thr. Reakciji katalizirata endogena encima ThrB in ThrC, ki se izražata iz operona '' thrABC ''. Za vzpostavitev rasti, odvisne od D-treonata, so tako ustvarili sev TW548, ki izraža gen za D-treonat dehidratazo iz bakterije rodu '' Herbaspirillum huttiense ''  (Hh.araD). Encim namreč pretvarja D-treonat v OHB, prekurzor homoserina. Za boljši privzem treonata iz okolja so kasneje v sev vnesli tudi gen za transporter treonata. Za izboljšanje tvorbe homoserina iz OHB pa so prekomerno izrazili gen za endogeno L-aspartat transaminazo (AspC) (sev TW504). Uspešna asimilacija GA je bila dosežena s sočasnim izražanjem gena za D-treoza aldolazo, D-treoza dehidrogenazo in D-treono-1,4-laktonazo (sev TW506). Ker so opazili zaviranje rasti pri povišani koncentraciji GA, so nadaljnja testiranja izvajali v mediju z 2 mM GA [2].

=== Biosinteza L-treonina iz glikolaldehida ===
V sevu TW64, ki je sintetiziral vse potrebne encime za celotno STEGA, transporter za izvoz Thr in konstitutivno izražene gene operona '' thrABC '', so z analizo supernatantov dokazali sintezo L-Thr iz GA. Izražanje genov so sprožili z dodatkom 0,5 mM IPTG ter po 24 h bakterijske kulture filtrirali in analizirali s tekočinsko kromatografijo sklopljeno z masno spektrometrijo  (LC/MS). Pri tem so v gojišču zaznali 0,53 mM L-Thr. Za določitev vira ogljika v nastalem L-Thr so uporabili <sup>13</sup>C-označen GA in z LC/MS analizo preverili stopnjo izotopske označenosti v različnih metabolitih. L-Thr in homoserin (njegov neposredni predhodnik) sta bila visoko označena, medtem ko Asp in Lys nista vsebovala označenega ogljika. To potrjuje, da <sup>13</sup>C-označena homoserin in L-Thr nista bila sintetizirana po naravni poti iz Asp, temveč izključno prek sintezne poti iz OHB [2].

Da bi preprečili ponovni vnos produkta iz gojišča, so iz sevov, ki L-Thr proizvajajo, zaporedoma izbili gen za transporter L-Thr ter ključne gene, povezane z metabolizmom L-Thr v Gly in Ile. Da bi preprečili sintezo Met iz homoserina, so odstranili tudi aktivnost homoserin O-sukciniltransferaze. Tako konstruirani sev TW2214 so nato opremili s celotno sintezno potjo asimilacije L-Thr iz GA, da so dobili sev TW2219, ki je bil sposoben proizvesti do 0,79 mM L-Thr brez opazne ponovne uporabe produkta [2]. 

Po dodatku označenega substrata se je začela kopičiti treoza, intermediat pri pretvorbi GA v L-Thr. Treoza je bila glavni produkt poti pri vseh časovnih točkah, medtem ko sta se treonat in OHB kopičila v precej nižjih koncentracijah. To nakazuje na ozko grlo pri encimih, ki pretvarjajo treozo. Skupno so 43 % ogljika iz GA zaznali v zunajceličnih metabolitih, kar pomeni, da se je pomemben delež ogljika preusmeril stran od ciljne poti. Na podlagi zasledovanja <sup>13</sup>C so sklepali, da se je del GA preusmeril v sintezo D-arabinoze-5-fosfata, ki nato vstopa v pentoza-fosfatno pot in sodeluje pri sintezi gradnikov celične stene [2].

=== Biosinteza D-treonata iz etilen glikola ===
Ko so zadovoljili poti sinteze L-Thr iz GA, so se osredotočili na začetni del, torej pretvorbo EG v D-treonat.

Za oksidacijo EG so uporabili od NAD<sup>+</sup> odvisno alkohol dehidrogenazo iz bakterije '' Gluconobacter oxydans ''. Ker pa je ta reakcija termodinamsko neugodna, so dodatno izrazili tudi gen za NADH oksidazo iz '' Streptococcus pneumoniae '', ki iz NADH in kisika tvori NAD<sup>+</sup> in vodo ter s tem poganja reakcijo naprej. Potrebne gene so vnesli v plazmid pACT3 pod nadzorom promotorja pTAC ter z njim tranformirali sev TW2214. Dobljeni sev so poimenovali TW2295. Izražanje so v eksponentni fazi rasti inducirali z 0,5 mM IPTG. Tako pripravljen sev TW2295 je proizvedel 1,42 mM treonata. Ko so znižali koncentracijo IPTG na 0,01 mM, se je proizvodnja treonata močno izboljšala – na 6,43 mM, zato so v nadaljevanju uporabljali to koncentracijo [2].

Ker je imela uporabljena D-treoza dehidrogenaza iz bakterije '' Paraburkholderia caryophylli '' (Pc.TadH) nizko afiniteto do nenaravnih substratov, so se osredotočili na iskanje novih encimov, ki ne bi povzročili kopičenja treoze. S testiranjem raznih homologov so z uporabo dehidrogenaze iz bakterije '' Xanthomonas campestris '' v 48 urah izboljšali proizvodnjo treonata za 69 % v primerjavi s Pc.TadH [2].

=== Biosinteza L-treonina in izkoriščanje etilen glikola ===
Sledilo je neposredno dokazovanje sinteze L-Thr iz EG z izražanjem vseh potrebnih genov v enem samem sevu. Uporabili so sveže rekonstituirane celice, inducirane z IPTG, in jih inkubirali v mediju s 320 mM EG ter bodisi 10 g/L glukoze bodisi glukoznim FeedBeads® za nadzorovano sproščanje glukoze v gojišče. Spremljali so rast celic, porabo substratov in nastanek produktov. Ugotovili so, da so celice uspešno pretvarjale EG v intermediate STEGA ter končni produkt L-Thr. Povišano sintezo (226 μM L-Thr po 48 h gojenja) so dosegli s sevom TW2494, ki izraža gen za transaminazo AspC in dehidratazo Hh.araD pod srednje močnim promotorjem PJ23107. V ločenih poskusih z nedelečimi-se celicami so prav tako zaznali sintezo L-Thr, kar pomeni, da pot ne zahteva aktivne delitve celic in lahko deluje kot biokatalitska osnova [2].

Ker je bil D-treonat glavni produkt poti, so domnevali, da je aktivnost Hh.araD, ki je odvisna od [2Fe-2S], lahko omejena zaradi pomanjkanja Fe-S skupkov. Da bi sprostili izražanje operona ''ISC'', odgovornega za sintezo Fe-S skupkov, so izbili gen za regulator operona (IscR). Novi sev TW2505 je dosegel 2,6-krat višjo koncentracijo L-Thr [2].

Čeprav se GA ni bistveno kopičil, pot vključuje vmesne reaktivne produkte, ki lahko tvorijo reaktivne kisikove zvrsti, ki vplivajo na encime, kot je D-treonat dehidrataza. Zato so preverili vpliv dodatne superoksid dismutaze in katalaze na biosintezo L-Thr. Izražanje gena za katalazo KatG je po 48 h gojenja omogočilo sintezo 6,53 mM L-Thr in boljšo porabo EG (67,72 mM; 22 % začetnega EG). Izražanje gena za superoksid dismutazo SodB pa je zmanjšalo kopičenje treonata, vendar ni izboljšalo sinteze L-Thr [2].

== Zaključek ==
V tej študiji so razširili nabor produktov STEGA in omogočili sintezo L-Thr iz GA in EG. Računalniška analiza je pokazala, da ima STEGA pot potencialno višje izkoristke in nižjo porabo kisika kot naravne in druge sintezne poti za sintezo L-Thr iz EG [2].

Nadaljnje encimsko inženirstvo ter uporaba evolucijskih pristopov bi lahko dodatno izboljšala aktivnost encimov in izkoristek sintezne poti. Kljub potrebnim optimizacijam gre za obetaven način pretvorbe trajnostnega ogljikovega vira EG v L-Thr [2].

== Viri in literatura ==
[1]	W. Leuchtenberger, K. Huthmacher, K. Drauz: Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 69, 1–8.

[2]	C. J. R. Frazão, N. Wagner, T. A. S. Nguyen, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of threonine from ethylene glycol. Metab. Eng. 2025, 88, 50–62.

[3]	C. J. R. Frazão, N. Wagner, K. Rabe, T. Walther: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of 2,4-dihydroxybutyric acid from ethylene glycol. Nat. Commun. 2023, 14, 1931.