View source for Komunikacije na podlagi RNA v heterogenih populacijah mimetičnih celic

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5c00657 RNA-Based Communication in Heterogeneous Populations of Cell Mimics] 

== UVOD ==

=== Nastanek in uporaba sinteznih celic ===
Posnemanje celičnih funkcij s konstrukcijo sinteznih celic iz neživih materialov nam omogoča spoznavanje nujnih življenjskih funkcij. Sintezne celice so lipidne kapsule, ki vsebujejo dele DNA in določene encime. Vsaka stvar se pripravi ločeno v laboratoriju, ki jih nato sestaviš skupaj od spodaj navzgor v sintezno celico [1,2]. Z modifikacijami sinteznih celic lahko preučujemo kompartmente v celicah, jih gensko modificiramo, ki se odzivajo na signale v okolju in še več. 

=== Regulacija z RNA ===
Eden izmed dobrih načinov regulacije teh celic je uporaba nukleinskih kislin, ki lahko tvorijo ortogonalne regulatorje. RNA je še posebej zanimiva, saj regulira in kodira sintezo proteinov, vendar je uporaba RNA signalov za regulacijo sinteznih celic trenutno še zelo neraziskano področje.

=== STAR in sprožilna RNA ===
V tej študiji so uporabili porozne polimere s programiranimi sinteznimi celicami  in z genetskim vezjem. Ideja je bila vzpostaviti regulacijo sinteze proteinov z RNA v heterogenih populacijah  pošiljateljskih in prejemniških celic. Izbrali so 2 RNA regulatorja. To sta majhna transkripcijsko aktivirajoča RNA (»a small transcription activating RNA« – STAR), ki bi delovala kot aktivator in sprožilna RNA, ki ob vezavi na lasnico spremeni obliko in omogoči translacijo [3,4]. To dvoje so združili v vrata IN. S temi vrati lahko preverjaš, kako vsak signal vpliva na celice ob različnih gostotah signala, oddaljenosti in odsotnosti signala.

== PRIPRAVA IN FUNKCIONALIZACIJA SINTEZNIH CELIC ==
=== Konstrukcija DNA ===
V raziskavi so uporabili plazmid J23119-S6T3-sfGFP-T500, kateremu so vstavili TetR, da je prišlo do fuzije TetR-sfGFP. TetR so uporabili za vezavo izraženih proteinov znotraj celice, da so lahko preverjali, katera celica se je aktivirala- Vezala s je na TetO regije prisotne na istem plazmidu. V vsak nespremenjen plazmid pa so dodali zapis STAR-a oz. zapis sprožilno RNA. Uporabili so metodo zlata vrata z NEBuilder HiFi DNA assembly. Plazmide so nato izolirali s kitom Midiprep.

=== Priprava izvlečka TXTL ===
Na začetku so namnožili E. coliBL21 Rosetta 2 na agarjevi plošči s kloramfenikolom. Za tem so piknili posamezno kolonijo in nacepili v tekoče gojišče ter naredili prekonočno inkubacijo pri 37 °C. Nato so prenesli v sveže gojišče in na novo namnožili celice. Po tem so jih izolirali iz gojišča in sonificirali, da so nastali celični lizati, ki so bili nato centrifugirani in na koncu so supernatante shranili pri -80 °C. Protokol je bil povzet po [5].

=== Proizvodnja sinteznih celic ===
Za proizvodnjo sinteznih celic so v študiji naredili polimer z dvojno emulzijo. Najprej so pripravili mikrofluidne čipe, ki so jih delno prevlekli z raztopino PVA in spekli pri 120 °C. Da je nastal polimer z dvojno emulzijo, so za zunanjo fazo uporabili vodno fazo in za notranjo so uporabili organsko fazo. Nato so ga polimerizirali za 30 sekund z UV svetlobo pri 365 nm. Po polimerizaciji so dodali etanol do 70 % (V/V). Pred združitvijo sinteznih celic s polimerom so celice očistili v čistem etanolu in za tem so izvedli pegilacijo, ki je potekala čez noč. Za barvanje celic so uporabili aminsko konjugirana fluorescentna barvila, ki se kovalentno povežejo s celicami.

=== Vstavljanje DNA v sintezne celice ===
V sinteznih celicah so imobilizirali DNA z uporabo njene visoke afinitete do glinastih hidrogelov. Pred vstavljanjem DNA in hidrogela so celice najprej očistili z vodo in nato so dodali glinasti hidrogel s prekonočno inkubacijo. Za tem so spet očistili preostanek hidrogela z vodo in nato dodali DNA in inkubirali 5 min. Za kvantifikacijo vstavljanja DNA so primerjali celice, ki so jim dodali DNA in celice, katerim so dodali vodo v oljnih kapljah podobne velikosti. Za analizo rezultatov so uporabili MATLAB.

== PREVERJANJE DELOVANJA IN VPLIV RAZLIČNIH FAKTORJEV NA REGULATORNE RNA ==

=== Načrtovanje vezja za RNA komuniciranje v sinteznih celicah ===
Za vzpostavitev komunikacije RNA med sinteznimi celicami so uporabili vrata IN iz dveh majhnih aktivatorjev RNA. Za aktivacijo vrat potrebuješ signal od obeh RNA. Prvo potrebuješ kratko RNA (STAR) za aktivacijo transkripcije in nato še sprožilno RNA, da prekine lasnico in omogoči translacijo. Vrata IN so reporterski konstrukt, ki je reguliran s tarčno regijo za STAR in sprožilno RNA, ki je navzgor od zapisa za fluorescentni reporterski protein sklopljen s TetR. Brez STAR-a pride do predčasne terminacije transkripcije, saj STAR prepreči tvorbo intrinzičnega terminatorja. Pomanjkanje sprožilne RNA pa onemogoči vezavo ribosoma na RBS, saj se tam tvori lasna zanka. Posledično se reporterski protein prepiše in prevede le v prisotnosti obeh molekul RNA.
Prvo preverjanje delovanje sistema je potekalo v velikih količinah, transkripcija in translacija sta potekali izven celic. Z visoko koncentracijo obeh RNA so zagotovili maksimalno aktivnost IN vrat, hkrati pa je prišlo do maksimalni signal GFP-ja, medtem ko najnižji je bil v odsotnosti obeh RNA. V primeru prisotnosti sprožilne RNA je prišlo do večjega puščanja, kot v primeru prisotnosti samo STAR. 
V naslednjem testiranju so želeli preveriti uporabnost STAR in sprožilne RNA kot signalni molekuli, ki potujeta do različnih sinteznih celic. V teh celicah so membrane permiabilne za vse reagente razen za DNA, ki pa je imobilizirana v celicah. Sklepali so, da bodo molekule RNA prehajale membrano. V ta namen so pripravili 3 tipe celic, kjer vsak tip celice vsebuje svoj plazmid. Ena vsebuje zapis za STAR, druga za sprožilno RNA in tretja vsebuje prejemniški plazmid. 

=== Načrtovanje in analiza komunikacijskih eksperimentov ===
Oddaljenost aktivatorskih RNA od prejemniških celic lahko vpliva na njeno uspešno transkripcijo in translacijo reporterskega gena. Tukaj so znanstveniki uporabili naključno porazdelitev celic po prostoru, ki vsebujejo različne plazmide. Za preverjanje so uporabili časovno zamaknjeno slikanje. S tem so preverili kako oddaljenost obeh signalov vpliva na sintezne celice.

=== Globalni in lokalni vpliv sinteznih celic na aktivacijo prejemniških celic ===
Prejemniške celice morajo integrirati oba signala RNA iz dveh različnih virov. Za tipično mRNA se to mora zgoditi v 17 minutah, saj sta življenjski dobi RNA in reakcije TXTL omejeni. Torej aktivacija prejemniških celic je odvisna od gostote signalov STAR-a in sprožilne RNA. Rast aktivacije prejemniške celice je korelirana z rastjo signalov STAR ali sprožilnih RNA. Sprememba koncentracij RNA ni enakovredna, saj opazimo višje koncentracije reporterskega proteina ob višjih koncentracijah STAR-a in manj sprožilne RNA, ob najmanj 12 signalov sprožilne RNA, vendar ni vidimo enakega učinka obratno, saj potrebujemo vsaj 100 signalov STAR za povišan signal reporterskega proteina. V primeru odsotnosti ene ali druge RNA opazimo, da v primeru odsotnosti STAR-a opazimo več puščanja v primerjavi z odsotnostjo sprožilne RNA.

=== Prostorska ureditev pošiljateljskih in prejemniških celic za vizualizacijo signalne propagacije ===
Kinetične analize so potrdile, da je prišlo do najvišje aktivacije signala ob prisotnosti obeh RNA in preden je prišlo do homogeniziranega odgovora. V ročno urejenih območjih, kjer so se nahajali skupki pošiljateljskih populacij in prejemniških populacij, so opazili veliko pristranskosti aktivacije signala ob skupkih z veliko STAR-a. V ostalih prostorih je bilo postopoma manj signala. Razlogi za to so verjetno počasnejša difuzija sprožilne RNA, manjše puščanje translacije in večje puščanje transkripcije brez prisotnosti STAR-a

== ZAKLJUČEK ==
Znanstveniki so torej dokazali, da sintetične regulatorne RNA lahko delujejo kot signalne molekule med sinteznimi celicami. S tem lahko neposredno aktivirajo transkripcijo in translacijo v sinteznih celicah, ki prejmejo signal. Bolj natančno so dokazali, da je aktivacija vezja IN vrat regulirana s STAR in sprožilno RNA iz dveh različnih populacij. Uporaba RNA kot signal odpira možnosti za množico novih ortoganonalnih komunikacij med celicami, saj sta de novo STAR in sprožilna RNA enostavno reprogramirana z novimi bazno-parnimi interakcijami [3,6]. Uporaba molekul RNA bo postala vse bolj uporabna v prihodnosti, saj lahko delujejo hitreje kot proteini in potrebujejo manj virov za svojo sintezo. Dokazali so tudi, da je translacija bila dosti močneje regulirana z lasno zanko brez prisotnosti regulatorne RNA, kot intrinzični terminator brez prisotnosti STAR-a
Zraven integracije dveh signalov iz dveh različnih virov so IN vrata dobra strategija, s katero lahko efektivno zmanjšamo puščanje izražanja v odsotnosti aktivatorjev [7,8]. V primeru, da je puščano izražanje problematično, lahko z uporabo dveh rahlo puščajočih regulatorjev in IN vrat naredimo tesno stanje v primeru odsotnosti obeh. S tem omogočamo aktivacijo samo v primeru prisotnosti obeh aktivatorjev torej STAR in sprožilna RNA. Hkrati so dokazali, da pride v prisotnosti obeh aktivatorski RNA do močne specifične aktivacije v prejemniških celicah, ki so v bližnji bližini virov od obeh aktivatorjev. 
Če vse povzamemo, bodo molekule RNA uporabni dodatek za sintezno biologijo in v inžiniringu sinteznih celic. Transkripcija majhnih RNA je hitra in prihrani razne vire. Veliko ortogonalnih virov bo sedaj možno združiti za tesno regulacijo. Uporaba RNA, ki imajo kratko življenjsko dobo, in izražanje izven celic bo omogočila implementacijo kratkoročnih komunikacij v primerjavi s stabilnimi počasno difuzijskimi proteini in hitro difuzijskimi majhnimi molekulami.


== LITERATURA ==
[1]	Chappell, J., Takahashi, M. K., & Lucks, J. B. (2015a). Creating small transcription activating RNAs. Nature Chemical Biology 2015 11:3, 11(3), 214–220. https://doi.org/10.1038/nchembio.1737

[2]	Chen, Y., Ho, J. M. L., Shis, D. L., Gupta, C., Long, J., Wagner, D. S., Ott, W., Josić, K., & Bennett, M. R. (2018b). Tuning the dynamic range of bacterial promoters regulated by ligand-inducible transcription factors. Nature Communications 2017 9:1, 9(1), 64-. https://doi.org/10.1038/s41467-017-02473-5

[3]	Ganzinger, K. A., & Schwille, P. (2019c). More from less – Bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science, 132(4). https://doi.org/10.1242/JCS.227488/57567

[4]	Green, A. A., Kim, J., Ma, D., Silver, P. A., Collins, J. J., & Yin, P. (2017d). Complex cellular logic computation using ribocomputing devices. Nature 2017 548:7665, 548(7665), 117–121. https://doi.org/10.1038/nature23271

[5]	Green, A. A., Silver, P. A., Collins, J. J., & Yin, P. (2014e). Toehold Switches: De-Novo-Designed Regulators of Gene Expression. Cell, 159(4), 925–939. https://doi.org/10.1016/J.CELL.2014.10.002

[6]	Kriebisch, C. M. E., Bantysh, O., Baranda Pellejero, L., Belluati, A., Bertosin, E., Dai, K., de Roy, M., Fu, H., Galvanetto, N., Gibbs, J. M., Gomez, S. S., Granatelli, G., Griffo, A., Guix, M., Gurdap, C. O., Harth-Kitzerow, J., Haugerud, I. S., Häfner, G., Jaiswal, P., … Boekhoven, J. (2025f). A roadmap toward the synthesis of life. Chem, 11(3), 102399. https://doi.org/10.1016/J.CHEMPR.2024.102399

[7]	Lehr, F. X., Pavletić, B., Glatter, T., Heimerl, T., Moeller, R., & Niederholtmeyer, H. (2024g). Enhanced assembly of bacteriophage T7 produced in cell-free reactions under simulated microgravity. Npj Microgravity 2024 10:1, 10(1), 30-. https://doi.org/10.1038/s41526-024-00378-4

[8]	Niederholtmeyer, H., Stepanoèa, È., & Maerkl, S. J. (2013h). Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(40), 15985–15990. https://doi.org/10.1073/PNAS.1311166110