View source for Konstrukcija na manitol odzivnih genetskih stikal na osnovi MtlR škatle

''Povzeto po članku'': [https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-023-00634-7 "F. Xiao, Y. Zhang, L. Zhang, Z. Ding, G. Shi in Y. Li: Construction of the genetic switches in response to mannitol based on artificial MtlR box. Bioresour. Bioprocess. 2023, 10."]


==Uvod==
Pri biotehnološkem pridobivanju raznih produktov se pogosto uporabljajo različni mikroorganizmi kot so bakterije, kvasovke, alge id. ''Bacillus licheniformis'' je ena izmed pomembnejših industrijskih bakterij, ki se uporablja za pridobivanje večjih količin amilaze in alkalne serinske proteaze, izkazuje pa tudi potencialno uporabo v bioremediaciji, biomineralizaciji in proizvodnji biogoriv. Pri tem se zaradi pomanjkanja ustreznih inducibilnih trenutno uporablja konstitutivne ekspresijske sisteme, kjer pa je regulacija količine proizvedenega produkta omejena, poleg tega pa lahko visoka ekspresija tarčnih genov negativno vpliva na rast celic. Avtorji članka so zato poskusili zasnovati nov inducibilni ekspresijski sistem v ''B. licheniformis'', ki predstavlja na manitol odziven stikalni sistem [1, 2]. 

Manitol je sladkorni alkohol, ki ga ''B. licheniformis'' lahko uporabi kot vir ogljika, kadar se znajde v okolju s pomanjkanjem drugih substratov; preferenčno uporabi glukozo. ''mtl'' operon je sestavljen iz dveh promotorjev in štirih strukturnih genov. Pod inducibilnim promotorjem PmtlA je uravnavana ekspresija ''mtlA'' in ''mtlF'', ki zapisujeta za EIICBMtl in EIIAMtl. Ta dva encima sta del manitolnega fosfotransferaznega sistema (PTS), ki je poseben način privzema te spojine in omogoča njeno nadaljno razgradnjo. Pod istim promotorjem in navzdol od obeh omenjenih genov se nahaja še ''mtlD'', ki zapisuje za manitol-1-fosfat dehidrogenazo, ki je prav tako pomemben encim v metabolizmu manitola. Navzdol od tega se pod inducibilnim promotorjem PmtlR nahaja zapis za MtlR, ki predstavlja transkripcijski regulator ekspresije vseh strukturnih genov v ''mtl'' operonu. V prisotnosti manitola tako nastane več MtlR in proteinov, ki so zapisani pod PmtlA, s čimer se preusmeri metabolizem celice v uporabo manitola, kadar ni prisotne glukoze [1, 2]. 

MtlR je 693 aminokislinski protein, sestavljen iz večih domen: 1. N-terminalna DNA vezavna domena, 2. osrednja domena iz dveh PRD (PTS regulacijska domena) in 3. C-terminalna domena. Njegovo delovanje je regulirano preko fosforilacije oz. defosforilacije PRDII, PRDI pa je vedno fosforilirana. V odsotnosti manitola sta torej obe PRD domeni fosforilirani, s čimer se zmanjša afiniteta MtlR do MtlR škatle, ki se nahaja v promotorskih in protein kodirajočih zaporedjih mtl operona, in zmanjša ekspresija. V prisotnosti manitola pride do ravno obratnega učinka, torej PRDII se defosforilira, fosforilira se manitol in poveča se ekspresija genov [2].

==Rezultati==

===Razvoj na manitol odzivnega genetskega stikala===
Avtorji so naredili enostavno genetsko stikalo, ki se je odzivalo na manitol. Z vektorjem pHY300-PLK z zapisom za eGFP, ki je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja Pshutle09, so transformirali celice ''B. licheniformis'' in po 6 h gojenja enemu vzorcu dodali manitol do končne koncentracije 1,5 %. MtlR se v celicah endogeno izraža, zato v vektor niso vključili zapisa zanj. Po 18 h gojenja so obema vzorcema določili intenziteto fluorescence in ugotovili, da ni prišlo do indukcije izražanja eGFP ''in vivo'', kar potrdi, da MtlR nima nespecifične afinitete, torej stikalo dejansko ni delovalo. To so potrdili tudi ''in vitro'' z EMSA (test zamika elektroforezne mobilnosti), kjer niso opazili lise, ki bi predstavljala vezane MtlR in fragmente Pshutle09 [2].

Nato so pripravili dva nova vektorja pPSAE in pPSBE, ki sta bila prejšnjemu podobna, dodatno pa sta imela v promotorju Pshutle09 med drugo -10 regijo in prvo -35 regijo vstavljeno MtlR škatlo A (iz ''B. licheniformis'') oz. B (iz ''B. subtilis''); promotor Pshutle09A in Pshutle09B. ''In vivo'' eksperiment je pokazal, da se je v neaktivnem stanju (stanje "OFF"), torej ko ni prisotnega manitola, vrednost intenzitete fluorescence v primeru Pshutle09A znižala za 53,28 %, v primeru Pshutle09B pa za 32,85 %. V aktivnem stanju (stanje "ON"), torej pri 1,5 % manitola, pa se je vrednost intenzitete fluorescence v primeru Pshutle09A zvišala za 29,57 %, v primeru Pshutle09B pa za 16,74 %. To nakazuje na boljše delovanje genetskega stikala s promotorjem Pshutle09A, saj ima večje dinamično območje (razmerje intenzitet fluorescence med "ON" in "OFF"), ki je 2,82-krat večje od stikala s promotorjem Pshutle09 [2].

===Racionalna zasnova genetskega stikala na osnovi MtlR škatle===
Glavni element genetskega vezja je MtlR škatla, ki je sestavljena iz levega in desnega dela psevdopalindromskega zaporedja, vmes pa je distančnik. Avtorji članka so najprej želeli preveriti vpliv psevdopalindromskega zaporedja na vrednosti intenzitet fluorescence v "OFF" in "ON" stanju, zato so s pomočjo OE-PCR (overlap extension PCR) in Pshutle09A skonstruirali dva nova promotorja (A-1 in A-2), ki sta imela spremenjen levi oz. desni del tega zaporedja. ''In vivo'' sta oba izkazovala nižji "ON" in "OFF" vrednosti, rezultate pa so potrdili tudi s promotorji z naključnimi zaporedji MtlR škatel. Majhno dinamično območje (1,03-krat, 1,02-krat) potrdi, da sta bili ti stikali nefunkcionalni, ''in vitro'' eksperiment pa nakazuje, da je psevdopalindromsko zaporedje ključno za vezavo MtlR [2]. 

MtlR škatli A in B se razlikujeta le v dolžini distančnika, kar pa je očitno pomembno pri delovanju genetskega stikala, saj je bilo že prej omenjeno, da je dinamično območje v primeru Pshutle09A večje od Pshutle09B. Zato so avtorji na podoben način skonstruirali še štiri promotorje (A-3, A-4, A-5 in A-6) z različno dolgim zaporedjem distančnika. Kot najboljši se je izkazal promotor A-4, ki imel 3 bp dolg distančnik in je ''in vivo'' pokazal za 62,83 % nižjo "OFF" vrednost in 43,35 % višjo "ON" vrednost v primerjavi s promotorjem Pshutle09. Tako so naredili genetsko stikalo s 3,87-krat večjim dinamičnim območjem. ''In vitro'' eksperiment je pokazal, da ima MtlR afiniteto do vseh MtlR škatel, zato velikost distančnika ni ključna determinanta, vseeno pa ima vpliv na jakost vezave MtlR [2].  

V ''B. licheniformis'' se MtlR škatle pojavljajo na različnih delih promotorskih zaporedij, zato so avtorji želeli določiti najboljšo pozicijo škatle. V ta namen so skonstruirali še tri promotorje (promotor A4-2, A4-3 in A4-4), ki so se razlikovali v poziciji škatle promotorja A-4 glede na dve -35 in dve -10 regiji promotorja Pshutle09. ''In vivo'' eksperiment je pokazal, da je bilo najboljše tisto stikalo, ki je imelo promotor A-4, kjer je bila MtlR škatla vstavljena med drugo -10 in prvo -35 regijo [2].

===Racionalna zasnova genetskih stikal na osnovi cre mest===
Avtorji so želeli povečati dinamično območje stikala, zato so v promotor dodali še cre mesto, ki omogoča vezavo CcpA. Ta deluje kot regulator ekspresije različnih genov, ki so udeleženi v katabolizem in anabolizem ogljikovih hidratov. V splošnem deluje tako, da omogoča celici preferenčno uporabo glukoze in zavira izražanje genov, ki omogočajo privzem in presnovo drugih virov ogljika, tudi manitola. cre mesta so prisotna v ''mtl'' operonu ''B. licheniformis'' in tudi na drugih delih genoma ter se razlikujejo v zaporedju in njihovi poziciji v promotorju. Na podlagi tega so skonstruirali šest promotorjev: promotorja A-4a in A-4b sta imela cre1 mesto, promotorja A-4c in A-4d sta imela cre2 mesto, promotorja A-4e in A-4f pa cre3 mesto. Promotorji A-4a, A-4c in A-4e so imeli cre mesta vstavljena med prvima -35 in -10 regijama, promotorji A-4b, A-4d in A-4f pa med MtlR škatlo in prvo -35 regijo. Vse eksperimente so izvedli na podoben način kot je že prej opisano, naj pa poudarim, da se tudi CcpA v celicah endogeno izraža, zato v vektorje niso vključili zapisa zanj. ''In vitro'' eksperiment je pokazal, da ima CcpA afiniteto do vseh cre mest v vseh promotorjih. ''In vivo'' se je kot najboljši izkazal promotor A-4e, ki je pokazal 60,05 % nižjo "OFF" vrednost (brez manitola in glukoze), 90,69 % nižjo "OFF" vrednost (glukoza), 41,60 % višjo "ON" vrednost (manitol) in 53,03 % nižjo "ON" vrednost (glukoza in manitol). Tako so naredili genetsko stikalo s 15,31-krat večjim dinamičnim območjem. Rezultati so potrdili, da na delovanje stikala vplivata pozicija in zaporedje cre mesta ter da oba regulacijska elementa delujeta neodvisno eden od drugega [2].

Stikalo s promotorjem A-4c je izkazovalo nekoliko drugačno delovanje. "OFF" vrednost (brez manitola in glukoze) je bila 63,37 % nižja, "OFF" vrednost (glukoza) 56,58 % nižja,"ON" vrednost (manitol) 40,00 % višja in "ON" vrednost (glukoza in manitol) kar 73,34 % višja. Najbolj opazni razliki sta v primerih, ko so celicam dodali glukozo oz. glukozo in manitol ter nakazuje na aktivacijsko delovanje cre2 mesta. Posledično se je temu genetskemu stikalu zmanjšalo dinamično območje. Vseeno pa bi lahko bilo uporabno v biotehnoloških aplikacijah, kadar bi želeli inducirati izražanje genov, ki so zapisani pod tem promotorjem, z manitolom in glukozo, saj je vrednost intenzitete fluorescence višja kot pa v primeru aktivacije stikala samo z manitolom [2].

==Zaključek==
Avtorji članka so skonstruirali več na manitol odzivnih genetskih stikal, ki so delovala na osnovi MtlR škatle. Temeljna želja je bila narediti stikalo, ki bo v odsotnosti manitola izkazovalo čim manjše izražanje genov, ki so pod kontrolo stikala, in v prisotnosti manitola izkazovalo čim večje izražanje teh genov. S tem namenom so v konstitutivni promotor dodali MtlR škatlo, ki je delovala kot osnovni element stikala, in uvajali različne spremembe tako v promotor kot omenjeno škatlo. V promotor so nato dodali še cre regulacijsko mesto, ki je delovalo kot element regulacije transkripcije in še izboljšalo dinamično območje stikala. Rezultati nakazujejo, da bi vsaj dve različni stikali lahko bili uporabni v biotehnoloških aplikacijah, v prihodnosti pa bi bilo potrebno raziskati še škatle v operonih, ki omogočajo transport in metabolizem drugih virov ogljika in energije, in vezavna mesta še drugih transkripcijskih faktorjev [2].


==Viri==
[1] F. Xiao, Y. Li, Y. Zhang, H. Wang, L. Zhang, Z. Ding, Z. Gu, S. Xu in G. Shi: Construction of a novel sugar alcohol-inducible expression system in bacillus licheniformis. ''Appl. Microbiol. Biotechnol.'' '''2020''', ''104'', str. 5409–5425.

[2] F. Xiao, Y. Zhang, L. Zhang, Z. Ding, G. Shi in Y. Li: Construction of the genetic switches in response to mannitol based on artificial MtlR box. ''Bioresour. Bioprocess''. '''2023''', ''10''.