View source for Metabolno inženirstvo bakterije Escherichia coli za pridobivanje floroglucinola iz acetata

==Uvod==

Rastline imajo veliko sposobnost sinteze aromatskih spojin, med katerimi prevladujejo fenolne spojine. Pripisujemo jim različne fiziološke in farmakološke aktivnosti: protimikrobni učinek, so antioksidanti … Floroglucinol je ena izmed fenolnih spojin s protivirusnim in protivnetnim delovanjem. Mnogi derivati floroglucinola imajo znatno farmakološko aktivnost in so široko uporabljeni v farmaciji (Straessler 2010). Trenutno je kemijska sinteza glavna metoda za produkcijo floroglucinola, a ima nekaj slabosti. Določeni substrati, ki se uporabljajo pri sintezi (TNT – trinitrotoluen, anilin …) so lahko vnetljive in eksplozivne ter toksične spojine. Kemijska sinteza je torej lahko nevarna in škodljiva okolju. V opisani študiji so se raziskovalci odločili slediti trendu mikrobne biosinteze različnih produktov, ki je v določeni meri bolj enostavna in okolju prijazna. V gensko spremenjenem sevu E. Coli so uspešno biosintetizirali floroglucinol, vir ogljika pa je bil relativno poceni acetat (Yu idr. 2020). 

==Eksperiment in rezultati==

Ker je znano, da so fenolne spojine toksične za mikroorganizme (Lima idr. 2016), so v študiji najprej preverili toksičnost floroglucinola za uporabljen sev E. Coli BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču M9Y na 30 °C in dodali od 0 do 5 g/L floroglucinola. Rast celic so potrdili z merjenjem OD600. Po 24 urah je v primerjavi s sevom, ki mu v gojišče ni bil dodan floroglucinol in sevom, ki mu je bil dodan 1 g/L floroglucinola, izmerjena OD600 vrednost padla za 1,43 krat. Rezultati so potrdili, da je spojina imela zaviralen učinek na rast celic, a se ta z višanjem koncentracije spojine ni zviševal. Iz tega je sledilo, da je sev zadovoljivo toleriral najvišjo koncentracijo floroglucinola, 5 g/L. 
Omenjen sev E. Coli so modificirali, da je proizvajala floroglucinol. Gen za floroglucinol sintazo (phlD) so pridobili iz genoma bakterije Pseudomonas fluorescens s pomočjo verižne reakcije s polimerazo (PCR) s prekrivajočima oligonukleotidoma. Encim floroglucinol sintaza pretvarja endogeni metabolit E. Coli malonil-CoA do floroglucinola. Količna prekurzorja malonil-CoA je bila glavni limitni element produkcije floroglucinola, zato so acetil-CoA karboksilazo, ki katalizira nepovratno karboksilacijo acetil-CoA v malonil-CoA, prekomerno izrazili, da je zagotavljala zalogo prekurzorja. Rezultati so potrdili, da je prekomerno izražanje omenjenega encima pospešilo in povečalo proizvodnjo floroglucinola.  
Sledilo je načrtovanje dveh različnih biosinteznih poti za proizvodnjo želene spojine iz acetata. V primeru prve poti acetil-CoA sintaza katalizira pretvorbo acetata do acetil-CoA. Pri drugi poti sta udeležena dva encima, fosfotransacetilaza in acetat kinaza, ki prav tako katalizirata pretvorbo acetata do acetil-CoA. Encimi obeh poti so bili  prekomerno izraženi. Rezultati so pokazali, da je acetat ustrezen vir ogljika in da ima biosintezna pot preko encimov fosfotransacetilaza in acetat kinaza večjo kapaciteto produkcije aceitl-CoA kot pot, ki jo katalizira acetil-CoA sintaza.

Znano je, da so ustrezni kodoni nujni za uspešno izražanje želenega proteina, kar pomeni, da manj pogosti kodoni znižajo izražanje (Sørensen 2001). S sistemom CRISPR/Cas9 so utišali gen GltA, katerega produkt katalizira pretvorbo oksaloacetat in acetil-CoA (iz acetata) v citrat, ki je vključen v ciklus citronske kisline. Utišanje so dosegli z zamenjavo pogostih kodonov za levcin z manj pogostim, CTA kodonom, in ustvarili večje število sevov z različnim številom zamenjav. Rezultati nakazujejo, da so uspešno utišali gen in s tem dosegli večjo preusmeritev toka ogljika v smer produkcije floroglucinola in manj v smer ciklusa citronske kisline.

==Zaključek==

Namen študije je bil biosinteza floroglucinola iz acetata, saj je ta alternativa dražjim virom ogljika (glukoza, lakotza, saharoza …). V študij zaključujejo, da za produkcijo koristnih spojin obstajajo še cenejši viri ogljika, ki se jih pridobi še lažje (melasa, glicerol, agrikulturni odpadki …), s čimer se znižajo stroški, hkrati pa se odpre še možnost ponovne uporabe odpadkov.
Proizvodnjo floroglucinola iz acetata so v opisani študiji sicer dosegli, a sam izkoristek acetata limitira produkcijo, saj rezultati kažejo, da višja koncentracija acetata ne korelira z višjo količino proizvedenega floroglucinola, kar namiguje na to, da presežka acetata gostiteljska bakterija ni mogla izkoristit. Potrebno bi bilo povečati asimilacijo acetata, kjer je verjetno efektivna strategija proteinski inžiniring encimov, ki sodelujejo (acetil-CoA sintaza, fosfotransacetilaza, acetat kinaza). 

==Viri==

Lima, Valéria N. idr. 2016. „Antimicrobial and enhancement of the antibiotic activity by phenolic compounds: Gallic acid, caffeic acid and pyrogallol“. Microbial Pathogenesis.

Sørensen, Michael A. 2001. „Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel- strains during amino acid starvation: A simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy“. Journal of Molecular Biology.

Straessler, Nicholas A. 2010. „Synthesis of trinitroaromatics using alternative mixed acid nitration conditions“. Synthetic Communications.

Yu, Shengzhu idr. 2020. „Metabolic engineering of E. coli for producing phloroglucinol from acetate“. Applied Microbiology and Biotechnology.