View source for Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola

[https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/1475-2859-7-36'''Metabolic engineering of ''Saccharomyces cerevisiae'' for the production of n-butanol ''']

(Tjaša Grum)

==Uvod==
Naraščajoči stroški energije in vse večja skrb za okolje so vplivali na razvoj proizvodnje obnovljivih goriv in kemikalij iz biomase. Trenutni standard biogoriva je etanol, vendar pa obstaja več razlogov za proizvodnjo in iskanje novih alternativ. Etanol ima namreč nizko energijsko gostoto, je higroskopen, ne da se ga napeljati po ceveh in je drag za destilacijo. V primerjavi z etanolom, je n-butanol bolj hidrofoben, ima višjo energijsko gostoto, lahko se transportira po napeljavi in se meša z bencinom v vseh razmerjih. Zaradi omenjenih lastnosti je n-butanol boljše biogorivo kot etanol. n-butanol se lahko proizvaja kemijsko iz nafte ali fermentacijsko iz različnih sevov bakterij iz rodu ''Clostridium''. Zaradi razvoja biotehnologije in podražitve nafte narašča zanimanje za fermentacijsko pridobivanje n-butanola. Vendar pa bakterije iz rodu ''Clostridium'' niso najbolj primerne za omenjeno proizvodnjo. Razlogi za to so naslednji: pomanjkanje genetskih orodij, s katerim bi lahko spreminjali njihov metabolizem, počasna rast, intoleranca na n-butanol (nad 1-2-odstotno vsebnostjo) in na kisik ter proizvodnja stranskih produktov (aceton, butirat, etanol). V članku so raziskovalci za gostiteljski organizem izbrali kvasovko ''Saccharomyces cerevisiae'', saj je ta genetsko obvladljiv in dobro opisan organizem, je trenutni industrijski sev, ki proizvaja etanol ter je bil v preteklosti že manipuliran za proizvodnjo drugih heterolognih metabolitov.

==Materiali in metode==
Gene bakterije ''Clostridium beijerinckii'' so klonirali iz genomske DNA. Gena ''phaA'' in ''phaB'' (iz bakterije ''Ralstonia eutropha''), gen ''adhe2'' (iz bakterije ''C. beijerinckii'') in gen ''ccr'' (iz bakterije ''Streptomyces collinus'') so bili sintetizirani. Vsi geni so bili pomnoženi s PCR s polimerazo Phusion. Začetni oligonukleotidi so bili načrtovani tako, da so imeli 30-bp dolge robne regije, ki so bile homologne insercijskim regijam (''gal1'' ali ''gal10'' promotorju in ''CYC1'', ''ADH1'' ali ''PGK1'' terminatorju) na plazmidu. Plazmide so konstruirali z metodo SLIC (od zaporedja in od ligacije neodvisno kloniranje), ki je nadgradnja metode LIC (od ligacije neodvisno kloniranje). Metoda omogoča združevanje številnih fragmentov DNA v eni sami reakciji z uporabo ''in vitro'' homologne rekombinacije in enoverižnega prileganja. Omenjena metoda posnema ''in vivo'' homologno rekombinacijo, ki so jo odkrili v ''E. coli''. Deluje na principu štrlečih koncev ssDNA v vključkih in vektorskih fragmentih, ki jih generira T4 DNA-polimeraza s svojo eksonukleazno aktivnostjo ter združevanju teh fragmentov z rekombinacijo ''in vitro''. Bakterija ''E. coli'', po transformaciji, dobljeni krožni produkt (z zarezami) enostavno popravi. SLIC vključke lahko naredimo tudi z nepopolnim PCR ali z mešanim PCR.  Dodatek proteina RecA (popravlja DNA) pred transformacijo, omogoča uporabo metode tudi pri zelo majhni koncentraciji DNA (npr. 3 ng).

Konstruirani plazmidi so izhajali iz plazmida p''ADS-AMO-CRP''-opt-''LEU2D''  in pESC-''HIS''. Pomnoževanje plazmidov je potekalo v bakteriji ''E. coli''. Celice so gojili pri 37 °C v LB mediju s 100 mg/L ampicilina. Starševski sev ''S. cerevisiae'' so gojili v bogatem YPD mediju pri 30 °C; spremenjeni sevi kvasovk pa so uspevali v SD mediju brez levcina, uracila, histidina in/ali metionina. Za induciranje genov, ki so bili pod promotorjema ''GAL1'' in ''GAL10'', so seve ''S. cerevisiae'' gojili ob prisotnosti 2-odstotne galaktoze, kot edinega vira ogljika. Kvasovke so transformirali z litijevim acetatom. Sevi ESY1-11 so bili konstruirani s kotransformacijo plazmidov, tej pa je sledila selekcija na ploščah SC-LEU ali SC-LEU-HIS.

Za analizo metabolitov so zbirali po 10 mL kulture po 24h, 72h, 120h in 144h. Za detekcijo n-butanola so 10 mL vzorca dodali 2 mL internega standarda (etil acetat, ki je vseboval n-pentanol) in vorteksirali 1 min. Nato so vzorce nanesli na plinsko kromatografijo (GC). Kvantifikacijska analiza je bila narejena s programom Xcalibur. Analizo intermediatov biosintezne poti pa so naredili s pomočjo tekočinske kromatografije sklopljene s tandemskim masnim spektrometrom (LC-MS/MS).

== Biosintezna pot n-butanola==
Biosintezno pot so zasnovali na podlagi biosintezne poti v  bakteriji ''C. beijerinckii'', kjer najprej encim tiolaza katalizira pretvorbo 2-acetil-CoA (AcCoA) v acetoacetil-CoA (AcAcCoA), slednjega nato 3-hidroksibutiril-CoA-dehidrogenaza pretvori v 3-hidroksibutiril-CoA (HbCoA), v naslednjem koraku pa se HbCoA s pomočjo encima krotonaza pretvori v krotonoil-CoA (CrCoA). Ta se v nadaljevanju z encimom butiril-CoA-dehidrogenaza pretvori v butiril-CoA (BtCoA). Slednji produkt se nato ob prisotnosti encima butiraldehid-dehidrogenaza pretvori v butiraldehid. Zadnjo stopnjo sintezne poti pa katalizira butanol- dehidrogenaza, ki butiraldehid pretvori v butanol. 

== Testiranje encimov in proizvodnja n-butanola==
Izražanje izoencimov biosintezne poti n-butanola iz različnih organizmov v ''S. cerevisiae'' privede do proizvodnje n-butanola. Za vsako reakcijo biosintezne poti so testirali več različnih encimov. Sevi ESY2, ESY3 in ESY4 so vsebovali encime iz bakterije ''R. eutropha'' (gen ''phaA'', ki kodira za tiolazo in gen ''phaB'', ki kodira za HbCoA-dehidrogenazo), ''S. collinus'' (gen ''ccr'', ki kodira za BtCoA-dehidrogenazo), ''C. beijerinckii'' (gen ''crt'', ki kodira za krotonazo in gen ''adhe2'', ki kodira za butiraldehid/butanol- dehidrogenazo), ''E. coli'' (gen ''atoB'', ki kodira za tiolazo) in iz kvasovke ''S. cerevisiae'' (gen ''ERG10'', ki kodira za tiolazo). Sevi so se razlikovali le v prvi stopnji sintezne poti (v encimu tiolaza). Encime iz ''R. eutropha'' so testirali zato, ker že obstajajo dokazi o njihovi visoki aktivnosti pri proizvajanju polihidroksialkanoatov v ''E. coli''. Ostali dve tiolazi pa so testirali zato, ker je ERG10 nativna tiolaza v ''S. cerevisiae'', encim AtoB pa zato, ker je že dokazana njegova uspešna uporaba pri prekomernem proizvajanju AcAcCoA v drugih metabolnih poteh. Izmed omenjenih sevov, je največjo količino n-butanola proizvedel sev ESY2 (1 mg/L), kar kaže na to, da je PhaA najboljša tiolaza za to biosintezno pot. 

Druga skupina sevov je vsebovala različne HbCoA-dehidrogenaze. Eden teh encimov (PhaB) kot kofaktor uporablja NADPH, drugi encim (Hbd) pa uporablja NADH. Najuspešnejši je bil sev ESY7 (''ERG10'', ''hbd''), ki je v primerjavi s prejšnjim najboljšim sevom (ESY2- ''phaA'', ''phaB'' ) podvojil količino proizvedenega n-butanola in dosegel količino 2,5 mg/L. Raziskovalcem se to ni zdelo presenetljivo, saj je omenjeni sev vseboval ERG10, ki je nativna tiolaza ter Hbd, ki uporablja NADH, ki ga je v fermentacijskih pogojih na voljo v zadostni količini. Opazili so tudi, da je sev, ki vsebuje gen za encim PhaA, v kombinaciji s Hbd manj učinkovit kot s PhaB. Mogoče je, da sta bila PhaA in PhaB med evolucijo optimizirana, da sodelujeta za boljšo proizvodnjo polihidroksibutirata v bakteriji ''R. eutropha''. 

S konstruiranjem zadnjega seva (ESY11) so preverili, če katera od alternativnih BtCoA-dehidrogenaz, za katere je bilo dokazano, da znatno povečajo proizvodnjo n-butanola v ''E. coli'', poveča količino n-butanola v primerjavi s sevom ESY7. Sev ESY11, ki je izražal encime Bcd (BtCoA-dehidrogenaza) in EtfAB (dva elektron prenašalna flavoproteina A in B) iz bakterije ''C. beijerinckii'', ni občutno povečal proizvodnje n-butanola. ESY11 je bil drugi najuspešnejši sev in se je od seva ESY7 razlikoval le v omenjeni BtCoA-dehidrogenazi.

== Analiza metabolitov biosintezne poti==
Z namenom, da bi razložili razlike med sevi in njihovo različno proizvodnjo n-butanola, so raziskovalci analizirali intermediate biosintezne poti. Razvili so LC-MS metodo za spremljanje vseh metabolitov v biosintezni poti n-butanola hkrati. Detekcija vseh metabolnih standardov je bila uspešna, prav tako je bila uspešna detekcija intermediatov (z izjemo AcAcCoA). Po 24h so bili nivoji AcCoA v sevih ESY4 in ESY7 nerazločljivi, medtem ko so bili nivoji HbCoA in BtCoA višji v sevu ESY7 kot v sevu ESY4. Pretvorba AcAcCoA v HbCoA je bila očitno uspešnejša z encimom Hbd  kot z encimom PhaB. Sev ESY11, ki se je  od seva ESY7 razlikoval zgolj v BtCoA-dehidrogenazi (Ccr v ESY7 in EtfAB/Bcd v ESY11), je akumuliral BtCoA, kar kaže na možno ozko grlo. S prenosom western so analizirali topnost Adhe2 in ugotovili, da je večina proteina v netopni frakciji. Povečano izražanje gena ''adhe2'' v sevu ESY11, bi lahko ublažilo akumulacijo BtCoA in izboljšalo proizvodnjo n-butanola. Raziskovalci so na podlagi rezultatov analize zaključili, da je nastanek HbCoA s HbCo-dehidrogenazo, stopnja, ki omejuje hitrost sinteze in odloča o nastanku n-butanola. 

==Zaključek==
V članku je prvič predstavljena vzpostavitev biosintezne poti n-butanola v kvasovki ''Saccharomyces cerevisiae''. Raziskovalci so testirali številne izoencime za različne stopnje v metabolni poti. Z izbiro ustreznih encimov so dosegli 10-kratno povečanje proizvodnje n-butanola (2,5 mg/L). Najučinkovitejši sevi so vsebovali encim 3-hidroksibutiril-CoA-dehidrogenaza iz bakterije ''Clostridium beijerinckii'', ki kot kofaktor uporablja NADH, in acetoacetil-CoA transferazo iz ''S. cerevisiae'' ali iz ''E. coli''. Izražanje genov, ki kodirajo za butiril-CoA-dehidrogenazo iz ''C. beijerinckii'' (''bcd'' in ''etfAB''), ni občutno izboljšalo proizvodnje butanola, kot so to predhodno omenjali pri ''E. coli''. Z analizo metabolitov so avtorji članka ugotovil katere stopnje omenjene biosintezne poti so težavne in zato primerne za optimizacijo v prihodnosti. V članku avtorji kot vodilo za nadaljnje študije navajajo primerjavo konstruiranih sevov (2,5 mg/L) z naravnimi sevi, ki proizvajajo n-butanol – ''Clostridium'' (približno 10 g/L) in pred kratkim pripravljeni sevi ''E. coli'' (približno 0,5 g/L).

==Viri==
E.J. Steen, R. Chan, N. Prasad, S. Myers, C.J. Petzold, A. Redding , M. Ouellet, J.D. Keasling: Metabolic engineering of ''Saccharomyces cerevisiae'' for the production of n-butanol. ''Microbial Cell Factories''. 2008.7:36. 

S.J. Elledge, L. MZ: SLIC: a method for sequence- and ligation-independent cloning. Methods in molecular biology. 2012.852:51-9.