View source for Metode za izolacijo DNA iz solinskega blata

Za izolacijo DNA smo uporabili osnovna postopka blage (encimske) lize in grobe lize z uporabo steklenih kroglic. Protokola sta bila opisana v članku E. Gabor in sodelavcev iz leta 2006 [1]. Izolacijo DNA iz vzorcev blat in petol smo izvajali v duplikatih. Kasneje se je izkazalo, da je bila ena od metod uspešnejša, zato smo za končno izolacijo DNA uporabili prilagojeno metodo. 

Prilagojeni postopek izolacije DNA:

V mikrocentrifugirke smo zatehtali 0,5 g blata/petole, ki so ga homogenizirali v 500 μl lizirnega pufra (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaEDTA, 1,5 M NaCl, 1 % CTAB, pH 8), mu dodali 0,4 g steklenih kroglic in ga na največji hitrosti mešali na vibracijskem mešalniku. Nato smo v mešanice dodali po 15 μl lizocima (50 mg/ml) in 0,75 μl RNaze A (10 mg/ml) ter mikrocentrifugirke inkubirali 30 min na 37 °C. Po dodatku 100 μl SDS (20 %) smo mešanice inkubirali 2 uri na 65 °C, pri čemer smo na pol ure mikrocentrifugirke premešali na roke. Po končani inkubaciji smo vzorce vsaj 3 min pri največji hitrosti mešali na vibracijskem mešalu. Vzorce smo nato centrifugirali 10 minut na sobni temperaturi na obratih 6000xg. Po končanem centrifugiranju smo supernatante zbrali v 15 ml centrifugirkah, nato pa izvedli reekstrakcijo z 250 μl lizirnega pufra, ki smo ga dodali sedimentu. Slednjega smo nato z mešanjem na vibracijskem mešalu poskušali čimbolj homogenizirati, nato smo mešanico inkubirali 10 min na 65 °C ter po končani inkubaciji centrifugirali 10 min na 6000xg. Ta postopek smo ponovili dvakrat. Zbrane supernatante smo uporabili za ekstrakcijo s kloroformom. Supernatantom smo dodali enak volumen kloroforma, raztopino premešali in centrifugirali 15 min na obratih 6000xg. Vodno fazo smo prenesli v nove 15 ml centrifugirke, ji dodali 0,6 V izopropanola ter shranili preko noči na 4 °C. Naslednji dan smo mešanice najprej centrifugirali 30 min na 10.000xg, zatem smo zavrgli supernatant, oborine pa raztopili v 1 ml 70 % etanola. Še enkrat smo centrifugirali na 10.000xg, tokrat 15 min. Supernatant smo odstranili in sediment popolnoma posušili na zraku. Sediment smo nato resuspendirali v 50 μl pufra TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM NaEDTA, pH 8). 

[1] Gabor, Esther & de Vries, Erik & B Janssen, Dick. (2003). Efficient recovery of environmental DNA for expression cloning by indirect methods. ''FEMS microbiology ecology''. 44. 153-63. 10.1016/S0168-6496(02)00462-2.